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Tecnicas de radiocompeticion proteica
Nociones de radioactividad:
La radioactividad es un fenomeno nuclear, es el proceso por el cual un nucleo inestable se
desintegra, perdiendo particulas o energia de excitación para formar una especie nuclear mas
estable.
El numero Z (protones) determina la identidad del elemento, pudiendo tener igual o mas
neutrones (isotopos). Muchos isotopos tienen nucleos inestables por exceso de masa, energia,
protones o neutrones y son radioactivos. Para estabilizarse pierden ese exceso emitiendo particulas
o fotones.
En el RIA (radioinmunoanalisis) se utilizan
125
I y
3
H(tritio) para marcar Ag. El
125
I posee
exceso de energia y emite fotones para estabilizarse que viajan por el espacio y tienen alta
penetrancia, esto se puede medir por unidad de tiempo en un contador de centelleo solido que
determina como interacciona con la materia. El
125
I se utiliza para marcar proteinas, en los residuos
de tirosina. Las hormonas esteroideas se marcan con tritio
3
H. El
3
H tiene exceso de neutrones que
se estabiliza generando beta
-
que inteacciona con la materia rapidamente ya que su penetrancia es
baja. La forma de marcar estas hormonas es mediante el reemplazo de algunos atomos de H de la
molecula por
3
H.
Radiocompeticion proteica
Las hormonas esteoideas y proteicas, vitaminas, entre otras sustancias, se encuentran en muy
baja concentracion en sangre (nanogramos/ml o picogramos/ml). Para detectarlas se necesitan
metodos de alta sensiblidad (detectan aun en muy bajas concentraciones) y especifidad (reconoce a
una sustancia en una mezcla compleja).
Se pone en un tubo de ensayo proteina ligadora junto a la sustancia que queremos ligar.
Estas proteinas pueden ser:
Plasmaticas: como la transcortina serica que determina glucocorticoides en fluidos biologicos; o la
proteina ligadora de esteroides sexuales para estradiol y testosterona.
Receptores celulares
Anticuerpos (Ac): este metodo se llama radioinmunoanalisis (RIA). Los Ac, inmunoglobulinas o
gamma-globlulinas aparecen en sangre tras la inyeccion de un antigeno (Ag), proteina o
macromolecula extraña. Esto genera Ac que se unen a los epitopes del Ag y forman el complejo Ag-
Ac. Los Ac tiene forma de Y en las dos puntitas tienen un
sitio de union complementario a los epitopes del Ag
llamados paratopes. Los anticuerpos necesarios se obtienen
en animales de laboratorio por inyeccion del Ag.
Al tubo de ensayo se le agrega una cantidad conocida
de la sustancia a dosar, o sea el Ag, pero marcada
radioactivamente (Ag*, tambien llamada trazador). La
presencia del atomo radiactivo en la molecula no debe
distorsionar ningun epitope. Asi el Ag y el trazador (Ag*)
competiran por su union al Ac. En resumen, se establece, dentro del tubo, una competencia entre las
moleculas marcadas y las no marcadas del Ag para unirse al Ac. Como la cantidad de Ac es
limitante, luego de un tiempo de incubacion se llega a un equilibrio en el que
parte del Ag se unio al Ac para formar el complejo Ag-Ac y otra parte quedo
libre en el medio. Lo misma sucede con Ag*. En el equilibrio habra:
complejos Ag-Ac, Ag*-Ac, Ag libres y Ag* libres. Cuanto mayor sea la
concentracion de Ag, mayor sera la cantidad del complejo Ag-Ac formado y,
por lo tanto, mayor sera la cantidad de Ag* desplazada.
Principio del radioinmunoanalisis (RIA)
El Ac anti-Ag se agega en concentraciones limitantes para establecer la competencia entre
Ag y Ag*. Hay una fraccion que forma complejo y una libre. Se separan ambas y se mide la
radioactividad en cada fraccion. A mayor cantidad de Ag en la muestra original, mayor cantidad de
complejos Ag-Ac y menor la de Ag*-Ac y mayor la de Ag* libre. La separacion de fracciones se
puede hacer por:
• precipitacion con segundo anticuerpo: un anticuerpo dirigido contra el anticuerpo utilizado
en el ensayo.
• Adsorcion de la fraccion libre: se usan materiales de alto poder adsorbente que retienen
moleculas de bajo PM
¿Como se relaciona la radioactividad con la concentracion de la sustancia a dosar presente en la
muestra?
Se prepara
simultaneamente una curva
patron con cantidades
conocidas y crecientes de Ag.
Todos los tubos, incluyendo los
de la muestra, tienen que tener
la misma cantidad de Ac y de
Ag* dado que la unica variable
del ensayo debe ser el Ag del a
muestra, y ser sometidos a las
mismas condiciones de
incubacion y separacion. A
mayor [Ag] mas se desplaza el
Ag* y menos complejos Ac-
Ag*. Se construye la curva
patron.
Los valores de radioactividad de las muestras pueden interpolarse en la curva para obtener las
concentraciones del Ag. Como las interpolaciones no son precisas, se transforma la curva en una
recta por un proceso matematico (LOGIT LOG) para recudir el error.
Las uniones inespecificas se dan entre Ag* y otras sustancias diferentes del Ac. Se usa un
tubo aparte pero sin Ac y se mide que cantidad formo union inespecifica. Ese valor se asume que en
todos los tubos ocurre en la misma proporcion.
IRMA (ensayo inmunoradiometrico)
A diferencia del RIA, este es un metodo NO competitivo que cuantifica Ag de alto PM con
varios epitopes. Este ensayo requiere dos Ac especificos contra epitopes diferentes del Ag, ambos
Ac tienen que estar en exceso. Un Ac se adsorbe (se pega) a una fase solida y el otro se marca
radiactivamente. Tras incubacion, se forman complejos Ac adsorbido – Ag – Ac marcado. Esto se
lava y se mide la radiactividad que va a ser proporcional a la concentracion de Ag.
Como se usan Ac en exceso, detecta Ag en muy baja concentracion. Es mas facil marcar Ac
como utiliza el IRMA, que Ag, como lo hace el metodo RIA.
ELISA
El enzimoinmunoanalisis es un metodo objetivo y automatizable. El analisis por enzimas
fijada a inmunoadsorbentes (ELISA) presenta como requisito que los Ac o Ag se puedan ligar a una
enzima que sea economica, con actividad elevada, facil de obtener en forma pura y cuya reaccion
con el sustrato sea de facil medicion. El Ac o Ag se une a una fase solida
ELISA indirecto
Es utilizado para la determinacion de Ac. La tecnica es la siguiente:
1. El Ag correspondiente se adsorbe a las placas de poliestireno, y luego se lavan.
2. Las muestras a ensayar se incuban en las concavidades y las placas se vuelve a lavar. El Ac
presente reacciona con el Ag pegado a la placa.
3. Se agrega antiinmunoglobulinas humana marcado con enzima y se lava. Este reacciona con
cualquier anticuerpo capturado en el paso anterior. Se vuelve a lavar.
4. Se agrega sustrato enzimatico y se incuban las placas. La velocidad de la degradacion se
indica por el cambio de color, que es proporcional a la concentracion de anticuerpo de las
muestras del paso (2).
5. Se detiene la reaccion y el color se determina en un espectrofotometro.
TP 18 radiocompetencia proteica.doc
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