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Seminario nº16: tecnologia del ADN recombinante y sus aplicaciones en la medicina
Los instrumentos basicos de la investigacion de genes
Enzimas de restriccion
Sirven para manipular segmentos especificos de ADN ya que reconocen y cortan (hidrolisis
de enlace fosfodiester) secuencias de bases especificas. Se nombran con una abreviatura de tres
letras que se refiere al organismo hospedador. Por ej: Eco (escherichia coli), Hin (Haemophilus
influenzae), seguida en su caso, de la cepa y un numero romano.
Tecnicas de transferencia o “blotting”
Southern blot se utiliza para separar y carateizar ADN, Northem blot, para ARN, y Western
blot para proteinas. Lo primero que se hace en todas estas tecnicas es una electroforesis en gel que
separa las moleculas por tamaño y carga: se aplica un campo electrico, los acidos nucleicos migran
al electrodo positivo ya que tienen cargas negativas. Luego hay que transferir los acidos nucleicos
desde el gel hacia un papel o membrana de nylon.
Los fragmentos se identifican con especifidad mediante sondas. Estas pueden ser ADN o ARN que
se unen al fragemento que buscamos por complementariedad de bases, proceso llamado hibridacion.
La sonda esta marcada con un nucleotido radiactivo, para poder identificarla tras su union. Luego
que la sonda ha hibridado, se lava la membrana y se visualiza la sonda por autorradiografia.
Secuenciacion de ADN
Es para determinar el orden de los nucleotidos en el ADN. Puede dar informacion sobre
enfermedades hereditarias y la investigacion forense.
El metodo de terminacion de la cadena se basa en que las moleculas de ADN simple se
pueden separar por electroforesis aunque varie 1 solo nucleotido su longitud. El metodo requiere
una hembra molde de ADN, un primer de ADN, una ADNpol, nucleotidos marcados
radiactivamente y nucleotidos modificados que terminan la elongacion.
Los fragmentos de ADN S' y marcados son desnaturalizados por calor y separados por
tamaño por electroforesis en gel de poliacrilamida-urea. Se visualizan las bandas de ADN mediante
autorradiografia y se puede leer la secuencia de ADN.
ADN producido por transcripcion reversa
Se S' a partir de un molde de ARNm mediante la enzima transcriptasa reversa.
Reaccion en cadena de la polimerasa (PCR)
Se agrega en un tubo: 1) una solucion que contenga el ADN con la secuencia a amplificar 2)
oligonucleotidos (sirven como primers), 3) los 4 desoxirribonucleotidos (dNTPs), 4) un buffer de
pH 7,4, 5) y una ADNpol estable al calor. Hay que conocer secuencias que flanquean el fragmento
de ADN interes. Los pasos a seguir son:
1. Separacion de las hebras originales por calentamiento a 95ºC.
2. Hibridacion de cebadores, por enfriamiento a 50-60ºC, se aparean los cebadores con las
hebras de ADN.
3. S' de ADN: la mezcla se caliente a 72ºC, temperatura adecuada para esta ADNpol. Ahora
comienza la elongacion de ambos cebadores copiando la secuencia blanco.
Estos 3 pasos forman el ciclo. Cada ciclo duplica el ADN, por lo que cada ciclo aumenta 2
n
la
cantidad de ADN original, siendo n el numero de ciclos. Se amplifica 1 millon de veces cada 20
ciclos aproximadamente y esto se puede hacer en menos de una hora.
La PCR puede aportar informacion valiosa en medicina
• Deteccion de bacterias y virus utilizando cebadores especificos: hepatitis B y C, HIV,
bacilos.
• Identificacion de personas para reconocimiento de cadaveres, parentescos biologicos.
• Establecer grupos tisulares especificos en transplantes
• Deteccion de organismos transgenicos
PCR en tiempo real
Es una variante de PCR que permite cuantificar el nivel de producto obtenido en cualquier
momento de la amplificacion mediante la señal de fluorescencia.
Cuantificacion y genotipado en clinica
La PCR en tiempo real posibilita tanto la cuantificacion como el genotipado (caracterizacion
de la cepa) de virus como el HBV (hepatitis B).
Polimorfismos del ADN
Son variaciones en las secuencias de ADN, que en el caso del genoma humano, existen
millones. Algunos polimorfismos que ocurren en secuencias codificantes de genes o en regiones
muy relacionadas a estos, estan involucrados en la etiologia de enfermedades heredables.
Se pueden estudiar la variaciones del ADN en sitios reconocidos por enzimas de restriccion
o por secuenciacion de ADN (mas preciso) analizando base por base.
Diagnostico de enfermedades hereditarias
Poliposis adenomatosa familiar (PAF): es una enfermedad autosomica dominante que desarrolla
miles de adenomas en colon y recto a partir de los 20 años. Es causado por una mutacion en un gen
supresor tumoral. El metodo utilizado para analizar esta mutacion es la secuenciacion del gen APC.
Farmacogenetica
Es la ciencia que estudia las variaciones heredadas en los genes que dictan la respuesta a
farmacos. Puede predecir si un paciente tendra buena, mala o ninguna respuesta a una droga. La
farmacogenomica es el estudio general de diversos genes que determian comportamiento a una
droga. Ej: en la leucemia se utiliza una droga para tratarla, algunos pacientes tienen cierta
concentracion de enzimas que la inactivan y pueden soportarla. Otros pacientes no tienen cantidad
suficiente de esta enzima y pueden sufrir severos efectos secundarios y muerte. Es necesario
conocer el gen que codifica esta enzima, para saber que variante del gen tienen y que tratamiento
aplicar.
Deteccion de polimorfismo que contienen regiones altamente variables
El ADN humano contiene regiones con secuencias hipervariables que se repiten (VNTRs
variable number of tandem repeats 15-100 pares de bases) o minisatelites de ADN, (STRs short
tandem repeats, entre 2-5 pares de bases). Estas secuencias son altamente personalizadas,
puediendose usar para identificar individuos con precision (huella genetica). Solo gemelos
monocigotos tendran la misma secuencia.
Los usos de la huella genetica incluyen la medicina forense, donacion de organos, pruebas
de paternidad.
Las muestras de ADN puede ser de cepillo de dientes, esperma, parientes de sangre, restos
humanos, hisopo bucal.
Ventajas de los STRs sobre los VNTRs: Se puede usar ADN degradado, y por su menor tamaño,
se puede diferenciar los fragmentos de ADN por una unica base.
Terapia genica
Es la transferencia in vivo o ex vivo de una secuencia genetica para reemplazar material
genetico defectuoso o conferir una nueva actividad a la celula.
Para introducir el gen “bueno” a las celulas, se pueden usar retrovirus(ARN) o adenovirus
(ADN lineal doble cadena). Existe riesgo que el ADN se introduzca en un gen funcional llevando a
la inactivacion de dicho gen. En caso que ese gen este relacionado a la proliferacion celular, podria
desarrollarse cancer.
TP 18 radiocompetencia proteica.doc
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