Volver a Microbiología y Parasitología I Cát. 2
I
Procedimientos en Microbiología Clínica
Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades
Infecciosas y Microbiología Clínica
Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantón
Coordinador: Jordi Vila Estape
Autores: Miriam Álvarez Martínez
Javier Buesa Gómez
Javier Castillo García
Jordi Vila Estape
ISBN-978-84-612-7852-7
30.
Diagnóstico
microbiológico de las
infecciones
gastrointestinales
2 0 0 8
II
INDICE DEL DOCUMENTO CIENTÍFICO
1. Introducción
2. Consideraciones clínicas
3. Recogida de muestras
4. Diagnóstico microbiológico de los diversos microorganismos causantes de infección gastrointestinal
4.1. Bacterias
4.1.1. E. coli diarreagénicas
4.1.2 Shigella spp.
4.1.3 Salmonella spp.
4.1.4. Campylobacter spp.
4.1.5 Yersinia spp.
4.1.6 Bacillus cereus
4.1.7. Staphylococcus aureus
4.1.8. Clostridium perfringens
4.1.9. Vibrio spp.
4.1.10. Aeromonas mesófilas
4.1.11. Plesiomonas shigelloides
4.1.12. Clostridium difficile
4.2. Virus
4.2.1. Aislamiento de virus en cultivos celulares
4.2.2. Microscopía electrónica
4.2.3. Técnicas de detección de antígenos víricos
4.2.4. Rotavirus
4.2.4.1 Detección de antígenos de rotavirus
4.2.4.2 Métodos moleculares
4.2.5. Norovirus
4.2.5.1 Detección de antígenos de norovirus
4.2.5.2 Métodos moleculares
4.2.6. Adenovirus
4.2.6.1 Detección de antígenos de adenovirus
4.2.6.2 Métodos moleculares
4.2.7. Astrovirus
4.2.7.1 Detección de antígenos de astrovirus
4.2.7.2 Métodos moleculares
4.2.8. Sapovirus
4.2.9. Interpretación e información de los resultados
4.3. Parásitos
4.3.1 Examen macroscópico
4.3.2 Examen microscópico
4.3.2.1 Examen en fresco
4.3.2.2 Técnicas de concentración
4.3.2.3 Tinciones específicas
4.3.2.4 Determinación de tamaños con el microscopio
4.3.3. Protozoos
4.3.3.1 Amebas
4.3.3.2 Flagelados
4.3.3.3 Ciliados
4.3.3.4 Coccidios
4.3.3.5 Microsporidios
4.3.4 Helmintos
4.3.4.1 Nematodos intestinales
4.3.4.2 Nematodos tisulares
4.3.4.3 Cestodos
4.3.4.4 Trematodos
5. Bibliografía
ÍNDICE DE LOS DOCUMENTOS TÉCNICOS
1. PNT-GE-01. Diagnóstico microbiológico de las infecciones gastrointestinales bacterianas
2. PNT-GE-02. Diagnóstico microbiológico de las infecciones gastrointestinales víricas
3. PNT-GE-03. Diagnóstico microbiológico de las infecciones gastrointestinales parasitarias
1
Procedimientos en Microbiología Clínica
Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades
Infecciosas y Microbiología Clínica
Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantón
Coordinador: Jordi Vila Estape
Autores: Miriam Álvarez Martínez
Javier Buesa Gómez
Javier Castillo García
Jordi Vila Estape
30. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE LAS INFECCIONES GASTROINTESTINALES
.
2008
2
1. INTRODUCCION
Las infecciones agudas del tracto gastrointestinal
figuran entre las enfermedades infecciosas más
frecuentes, superadas sólo por las infecciones del
tracto respiratorio. Aunque muchas veces se trata
de un ligero contratiempo en los adultos sanos, un
desequilibrio electrolítico puede provocar una
deshidratación en las personas muy enfermas y en
niños y ancianos. A nivel mundial, las infecciones
gastrointestinales siguen siendo una de las causas
más importantes de morbilidad y mortalidad entre los
lactantes y los niños. Se ha estimado que en Asia,
África y Latinoamérica, dependiendo de factores
socioeconómicos y nutricionales, la probabilidad de
que un niño muera antes de los 5 años por estas
causas puede llegar al 50%. Las epidemias de
diarrea en lactantes, niños y adultos son
generalmente causadas por microorganismos
presentes en el agua o en los alimentos
contaminados habitualmente por heces que
presentan microorganismos patógenos. Las
infecciones también se pueden transmitir de persona
a persona por contacto directo o a través de fómites.
2. CONSIDERACIONES CLÍNICAS
Las manifestaciones clínicas más destacadas de
las gastroenteritis son fiebre, vómitos, dolor
abdominal y diarrea moderada a intensa. La diarrea
es un dato central y su presencia y naturaleza
constituyen la base para la clasificación de las
infecciones gastrointestinales en dos síndromes:
diarrea acuosa o secretora y diarrea invasiva o
disentería.
Diarrea acuosa o secretora. La forma más común
de gastroenteritis se caracteriza por evacuaciones
intestinales frecuentes, más o menos líquidas,
denominadas diarrea. La diarrea está provocada por
mecanismos patogénicos que atacan el intestino
delgado proximal, porción del intestino en la que se
produce más del 90% de la absorción fisiológica de
fluidos. La forma más pura de diarrea acuosa es la
producida por bacterias secretoras de enterotoxinas,
como por ejemplo Vibrio cholerae o Escherichia coli
enterotoxigénica (Tabla 1).
Tabla 1. Características de los síndromes gastrointestinales infecciosos más importantes
Microorganismo
a
clínico
Síndrome Mecanismo patogénico
(Factores de virulencia)
ECET Diarrea acuosa Fimbrias, toxinas termolábil (TL) y
termoestable (TE)
ECEP Diarrea acuosa Adherencia – acortamiento microvellosidades
ECEI Disentería Plásmido (genes codifican proteínas de
invasión)
ECEH Diarrea acuosa
Colitis hemorrágica (síndrome urémico-
hemolítico)
Fimbrias, citotoxinas (VT-1 o VT-2)
ECEA Diarrea acuosa Fimbria, enterotoxina (EAST-1)
¿otras toxinas?
Shigella Diarrea acuosa/disentería Plásmido de invasión, citotoxinas (VT-1 o VT-
2)*
Salmonella Diarrea acuosa o disentería Invasión, enterotoxinas (similar TL de ECET)
Campylobacter Diarrea acuosa o disentería Invasión, enterotoxinas (similar TE de ECET)
Y. enterocolitica Diarrea acuosa o disentería Invasión, enterotoxinas (similar TE de ECET)
V. cholerae
Diarrea acuosa Fimbrias, toxina termolábil (TL)
C. difficile
Diarrea acuosa Citotoxina
Rotavirus
Destrucción mucosa
Giardia lamblia
Irritación mucosa
Entamoeba histolytica
Disentería Invasión mucosa
a
ECET: E. coli enterotoxigénica; ECEP: E. coli enteropatógena; ECEI: E. coli enteroinvasiva; ECEH: E. coli
enterohemorrágica; ECEA: E. coli enteroagregativa.
* Sólo presenta las citotoxinas la especie S. dysenteriae
Diarrea invasiva o disentería. La disentería
comienza con evacuaciones intestinales frecuentes,
pero las heces son de menor volumen que en la
diarrea acuosa y contienen sangre, moco y pus. La
fiebre, el dolor abdominal y el tenesmo son síntomas
habituales. En la disentería, la patología se centra en
el colon. Los microorganismos (Tabla 1) que causan
disentería pueden provocar cambios inflamatorios y
destructivos en la mucosa del colon, por invasión
directa o mediante la producción de citotoxinas. Este
daño es responsable del pus y la sangre observados
en las heces, pero no origina una pérdida importante
de fluido, debido a que la capacidad de absorción y
secreción del colon es mucho menor que la del
intestino delgado. Los síntomas y los signos pueden
variar de modo significativo de unos pacientes a
DOCUMENTO CIENTÍFICO
2
otros, e incluso, en momentos distintos durante la
evolución de la misma enfermedad. Por ejemplo las
infecciones por Shigella pasan con frecuencia por un
estadio inicial breve de diarrea acuosa antes de
localizarse en el colon y ocasionar una disentería.
Ante la sospecha de un cuadro de gastroenteritis
debe hacerse una detallada historia clínica y un
correcto estudio microbiológico. Los antecedentes
epidemiológicos (edad, historia reciente de viajes,
fundamentalmente a países subtropicales y
tropicales, aparición esporádica o como parte de un
brote, tipo de alimento sospechoso, periodo de
incubación), la existencia de factores predisponentes
(inmunosupresión), la presencia de signos y
síntomas clínicos (fiebre, dolor abdominal, nauseas y
vómitos) y el tipo de diarrea (acuosa o disentérica)
pueden orientar acerca del microorganismo
implicado. No obstante, el diagnóstico definitivo solo
se puede obtener mediante pruebas de laboratorio.
Diarrea del viajero. Las personas que viajan desde
países desarrollados a otros en vías de desarrollo,
pueden experimentar una gastroenteritis durante el
viaje o al regreso al país de origen. La ingestión de
alimentos crudos o poco cocinados o bien el agua
contaminada es la fuente más probable de infección.
Los microorganismos que con mayor frecuencia
causan diarrea del viajero se mencionan en la Tabla
2. Entre ellos cabe destacar las E. coli
enterotoxigénicas y enteroagregativas.
Tabla 2. Etiología de las gastroenteritis en diversos grupos de población
Microorganismo Niños (0-5 años)
Países desarrollados
Niños (0-5 años)
Países en vías de
desarrollo
Adultos DV*
Bacterias
E. coli
ND 37% ND 42%**
Shigella spp.
<1% 10% <1% 10%
Salmonella spp.
25% 1,5% 60% 3%
Campylobacter spp.
40% 3% 5% 2%
Y. enterocolitica
2% <1% 2% 2%
Aeromonas spp.
7% 1% 6% 2%
Virus
Rotavirus
44% 24% ND 1%
Parásitos
G. lamblia
35% 10% ND 10%
E. histolytica
<1% 3% 5% 7%
* DV = Diarrea del viajero.
** E. coli diarreagénicas: E. coli enterotoxigénica (16%), E. coli enteroagregativa (13%), E. coli enteropatógena
(4%), E. coli enteroinvasiva (3%) y E. coli verotoxigénica (1%)
ND = No determinado.
Toxiinfección alimentaria. En la mayoría de las
infecciones gastrointestinales participan alimentos
como vehículos de transmisión. Sin embargo, el
término intoxicación alimentaria suele reservarse
para los casos en los que puede incriminarse en su
génesis a una sola comida. Esta situación se plantea
de modo típico cuando se desarrollan al mismo
tiempo múltiples casos de idéntico síndrome
gastrointestinal, entre personas que sólo tienen en
común haber compartido una comida en alguna
reunión social o en un restaurante determinado.
Diarrea relacionada con el hospital. El medio
ambiente hospitalario no debe permitir la
diseminación de los agentes habituales de infección
intestinal endémica. Cuando se produce tal infección,
en general puede atribuirse a un empleado que
continua trabajando mientras está enfermo o bien es
portador sano o a comidas contaminadas,
preparadas en el propio hospital o bien fuera del
hospital y que entran en éste a través de familiares o
amigos del paciente. Dos casos especiales de
diarrea asociada con el hospital son las causadas
por E. coli enteropatógenas en lactantes y por
Clostridium difficile en pacientes con tratamiento
antibiótico. C. difficile es la causa más importante de
diarrea nosocomial, por ello en algunos laboratorios
se utiliza como criterio el no realizar un coprocultivo
en pacientes que han desarrollado diarrea después
de tres días de estar ingresados en el hospital. En
este caso el único microorganismo que se investiga
es C. difficile toxigénico.
2
3. RECOGIDA DE MUESTRAS
La toma de muestra fecales y su transporte al
laboratorio de microbiología se ha comentado en
detalle en el número 1a de los Procedimientos en
Microbiología Clínica de la SEIMC. Brevemente, las
muestras para cultivo se deben recoger lo antes
posible en el curso de la enfermedad, siendo poco
aconsejable recogerlas con escobillón. Se deben
recoger en un frasco estéril de boca ancha y tapón a
rosca y enviarlas en el medio de transporte
adecuado. Si se desea investigar parásitos, se
recogerán tres muestras en tres días distintos (no en
el mismo día) e igualmente se incluirán en un frasco
estéril con el correspondiente medio de transporte
(ver procedimiento 1a de los Procedimientos en
Microbiología).
4. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE LOS
DIVERSOS MICROORGANISMOS CAUSANTES
DE INFECCIÓN GASTROINTESTINAL
Durante los últimos 20 años se han logrado
grandes avances en el conocimiento de las
infecciones gastrointestinales. Los microorganismos
incluidos en la tabla 1 producen hoy en día el 60-
80% de los casos, aunque en muchos laboratorios
no se dispone de métodos diagnósticos apropiados
para todos ellos. La participación de los distintos
microorganismos difiere de unas áreas geográficas a
otras y también depende del grupo de población
estudiado (Tabla 2). En cuanto al predominio
estacional hay mayor incidencia de gastroenteritis
vírica en otoño-invierno mientras que las bacterias
afectan preferentemente en primavera-verano. En
países tropicales este comportamiento estacional
también se observa, con una mayor prevalencia de
gastroenteritis por rotavirus en la época seca que en
la época de lluvias.
4.1. BACTERIAS
4.1.1. Eschericia coli diarreagénicas. Actualmente
se aceptan cinco grupos de E. coli como causantes
de gastroenteritis: 1) E. coli enterotoxigénica
(ECET) cuyas cepas pueden ser productoras de una
o ambas toxinas, la toxina termolábil (TL), codificada
en los genes lt y la toxina termoestable (TE),
codificada en el gen st. Ambas toxinas producen una
elevada secreción de electrolitos y agua a través de
la activación de la adenilato ciclasa y la guanilato
ciclasa del enterocito, respectivamente. Este grupo
es causa frecuente de diarrea del viajero y de diarrea
en niños con edad inferior a 5 años en países en
vías de desarrollo; 2) E. coli enteropatógena
(ECEP), este grupo se adhiere al epitelio intestinal
ocasionando un acortamiento de las
microvellosidades. El locus LEE, que codifica una
serie de proteínas asociados con la adherencia y
destrucción de las microvellosidades, se encuentra
localizado en una isla de patogenicidad; 3) E. coli
enterohemorrágica (ECEH) también llamada
verotoxigénica pues puede producir dos citotoxinas
denominadas toxinas Shiga-like (Stx1 y Stx2),
shigatoxinas o verotoxinas. Los cuadros clínicos que
produce van desde una infección asintomática a
diarrea acuosa o colitis hemorrágica, que a veces se
acompaña de un síndrome urémico-hemolítico; 4) E.
coli enteroinvasiva (ECEI), los cuales son capaces
de invadir la mucosa intestinal; y 5) E. coli
enteroagregativa (ECEA) que es también una
causa frecuente de diarrea del viajero y de diarrea
crónica en países en vías de desarrollo. El
mecanismo de acción de este último grupo de E. coli
diarreagénicas no se conoce en detalle aunque se
ha descrito que un elevado porcentaje de cepas
poseen un plásmido (CVD432) en el que se localiza
el gen aat que codifica una proteína transportadora y
se utiliza para detectar ECEA por PCR (Tabla 3).
Tabla 3. Cebadores utilizados para la amplificación de diversos factores de virulencia de E. coli diarreagénicas
Gen Factor de virulencia Secuencia cebadores
Tamaño amplicon
(pb)
aat Proteína transportadora
5’ CTGGCGAAAGACTGTATCAT 3’
5’ AATGTATAGAAATCCGCTGTT 3’
629
lt Toxina termolábil 5’ TCTCTATGTGCATACGGAGC 3’ 5’
CCATACTAGTTGCCGCAAT 3’
322
st Toxina termoestable
5’ TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG 3’
5’ CTTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC 3’
147
sxt-1 Verotoxina-1
5’ GAAGAGTCGTGGGATTACG 3’
5’ AGCGATGCAGCTATTAATAA 3’
130
sxt-2 Verotoxina-2
5’ TTAACCACACCCACGGCAGT 3’
3’ GCTCTGGATGCATCTCTGGGT 3’
346
2
El diagnóstico microbiológico de los procesos
enterocolíticos causados por los diferentes grupos de
E. coli diarreagénicas se ve complicado por el hecho
de que esta especie es un componente fundamental
de la microbiota intestinal del ser humano. El agar
MacConkey se incorpora normalmente en los
coprocultivos y se puede utilizar para el aislamiento
de E. coli. Una vez identificado como E. coli se
pueden detectar los diversos patotipos de E. coli
diarreagénicas mediante la detección de los genes
que codifican los diversos factores de virulencia
(Tabla 3). Sin embargo, la identificación de estos
tipos de E. coli queda fuera de la práctica rutinaria de
la mayoría de laboratorios, aunque en aquellos con
un elevado número de pacientes con diarrea del
viajero es aconsejable su implementación.
El principal serotipo de E. coli enterohemorrágico es
el O157:H7; este serotipo posee la pecularidad de no
fermentar el D-sorbitol por lo que se puede utilizar el
agar MacConkey- sorbitol, que es una modificación
de este medio que incorpora este azúcar en lugar de
lactosa, para la identificación presuntiva de dicho
serotipo. Una vez identificadas como E. coli las
colonias no fermentadoras del sorbitol, se procede a
aglutinar con anticuerpos específicos para O157. Los
protocolos para la detección rutinaria de E. coli
enterohemorrágica varían enormemente. Basándose
en la baja incidencia de la gastroenteritis por este
tipo de E. coli algunos laboratorios no realizan
cultivos rutinarios y otros los realizan cuando el
clínico lo solicita. Algunos laboratorios realizan
cultivo en MacConkey-sorbitol sólo cuando las heces
son sanguinolentas, pues este patotipo de E. coli
puede ocasionar una colitis hemorrágica.
La diarrea moderada ocasionada por ECET o ECEA
es normalmente autolimitada. Sin embargo, se ha
comprobado que cuando la diarrea es más grave o
prolongada la utilización de fluoroquinolonas como
ciprofloxacino o norfloxacino disminuye la
sintomatología. En los casos de diarrea del viajero
en pacientes que han viajado a India se debe pensar
en utilizar una alternativa a las fluoroquinolonas pues
en los últimos años el nivel de resistencia a estos
agentes antibacterianos en cepas de ECET y ECEA
de este país ha aumentado considerablemente. Una
posible alternativa es el uso de rifaximina, un agente
antibacteriano no absorbible que posee una buena
actividad frente a ECET y ECEA.
4.1.2. Shigella spp. El género Shigella está
constituido por bacilos Gram-negativos inmóviles, no
capsulados que no fermentan la lactosa y son
fermentadores de la glucosa con producción de
ácido pero no de gas. Este género posee cuatro
especies y cada especie varios serotipos: Shigella
dysenteriae (serogrupo A, trece serotipos), Shigella
flexneri (serogrupo B, seis serotipos), Shigella boydii
(serogrupo C, 18 serotipos) y Shigella sonnei
(serogrupo D, un serotipo). Los únicos huéspedes
naturales de Shigella son el humano y algunas
especies de primates. Son altamente transmisibles
con una dosis infecciosa muy baja, del orden de 200
microorganismos. La transmisión tiene lugar a
través de alimentos contaminados con heces, por las
manos, fómites o incluso por las moscas. S. flexneri
es el aislamiento más común en muchas partes del
mundo, pero S. sonnei predomina en América del
Norte y en Europa.
El examen de leucocitos en heces resulta de ayuda
pues las shigellas ocasionan una diarrea disentérica
por invasión de las células del colon. Los cultivos
deben realizarse con muestras de las partes fecales
con moco, pus o sangre. Las colonias típicas de
Shigella en agar MacConkey son transparentes ya
que no fermentan la lactosa. Las heces se pueden
inocular en medios de cultivo moderadamente
selectivos, como el Hektoen o el agar XLD (xilosa-
lisina-deoxicolato). Esta bacteria forma colonias
verdes transparentes en agar Hektoen (no hay
fermentación de la lactosa ni producción de ácido
sulfhídrico) y colonias transparentes en agar XLD (no
fermentación de xilosa ni modificación de la lisina).
En tubos de agar triple azúcar-hierro (TSI) o Kligler,
produce una superficie alcalina (no fermentación de
la lactosa), un fondo ácido (fermentación de la
glucosa) y no hay producción de gas ni ácido
sulfhídrico. Aunque se puede utilizar el agar
Salmonella-Shigella, este no se recomienda por el
bajo rendimiento para aislar S. sonnei. Ante la
sospecha de una shigella se recomienda en primer
lugar una identificación bioquímica presuntiva con
TSI o Kligler y LIA (Agar lisina-hierro), a continuación
se puede realizar una identificación serológica
mediante la aglutinación con antisueros específicos.
El tratamiento de la gastroenteritis aguda por
Shigella incluye la valoración del grado de
deshidratación. Se ha demostrado que la hidratación
oral ha sido de ayuda para rehidratar a niños con
diarrea invasiva. La administración de un antibiótico
apropiado acorta la enfermedad, elimina más
rápidamente la shigella de las heces y disminuye las
complicaciones potencialmente graves. Debido a los
elevados niveles de resistencia a la ampicilina y al
trimetoprim-sulfametoxazol observados en los
últimos años se ha sugerido como alternativa el
tratamiento con una fluoroquinolona o una
cefalosporina de tercera generación. Sin embargo, y
al igual que se ha descrito para E. coli
enterotoxigenica y E. coli enteroagregativa, se aíslan
cepas de Shigella resistentes a fluoroquinolonas
causantes de diarrea del viajero en individuos que
han viajado a la India.
4.1.3. Salmonella spp. El género Salmonella está
formado por un grupo muy heterogéneo de bacterias
que colonizan el intestino de numerosas especies
animales y del hombre. Este género está constituido
por bacilos Gram-negativos, aerobios o anaerobios
facultativos, móviles (flagelos peritricos), fermentan
la glucosa, maltosa y manitol, pero no la lactosa ni la
sacarosa. Poseen antígeno somático (O), antígeno
flagelar (H) y pueden tener antígeno de virulencia
(Vi), este último es un polisacárido termolábil
localizado en la cápsula. El sistema de clasificación
más comúnmente utilizado agrupa a Salmonella por
especies, subespecies y serotipos. Mientras que
Salmonella typhi y Salmonella choleraesuis tienen un
serotipo, Salmonella enterica tiene más de 2.300
3
serotipos diferentes. En el esquema de Kaufmann-
White, varios serotipos de Salmonella se clasifican
dentro de diferentes serogrupos. Los serogrupos
están basados en un antígeno mayor y uno o más
antígenos somáticos menores. Recientemente, se ha
desarrollado un esquema de clasificación, que se
basa en las técnicas de hibridación de ácidos
nucleicos. Se han identificado seis genogrupos, sin
embargo, casi todos los serotipos importantes como
causa de patología infecciosa en humanos
pertenecen al subgrupo 1. Los otros subgrupos están
constituidos por serotipos aislados normalmente del
ambiente o de animales de sangre fría. Los serotipos
causantes de enteritis varían según la localización
geográfica, siendo los más frecuentes en nuestra
área Enteritidis y Typhimurium. La nomenclatura
recomendada para las salmonelas comporta escribir
el nombre de la especie en cursiva seguido del
serotipo en redonda y con su primera inicial en
mayúscula (por ejemplo: Salmonella enterica serovar
Typhimuirum).
La transmisión se efectúa por consumo de alimentos
de origen animal contaminados, fundamentalmente
aves, huevos, ganado vacuno y cerdos, o a partir de
portadores asintomáticos que manipulan y
contaminan alimentos o, más raramente, de persona
a persona, sobre todo en guarderías y hospitales. La
infección se localiza en el íleon y colon, por
penetración de las células epiteliales y migración
hasta la lámina propia, lo que da lugar a una
respuesta inflamatoria. La infección es muchas
veces autolimitada aunque en algunos casos puede
acompañarse de bacteriemia transitoria, sobre todo
en lactantes y ancianos.
El diagnóstico etiológico sólo se puede efectuar con
seguridad mediante coprocultivo. Se utilizan medios
selectivos diferenciales y medios de enriquecimiento.
La utilización de medios líquidos de enriquecimiento
como el caldo de selenito es fundamental cuando se
trata de estudiar portadores asintomáticos, ya que en
estos casos suele eliminarse sólo una baja
concentración de salmonelas en heces. Sin
embargo, en algunos laboratorios el caldo de
selenito, debido a su toxicidad ha sido reemplazado
por el caldo de Rappaport. Los caldos enriquecidos
son también recomendables en cuadros de
gastroenteritis agudas con objeto de inhibir la flora
fecal competitiva, aunque el elevado número de
salmonelas presente en las heces en estos casos no
los hace indispensables. El aislamiento de
salmonelas se puede realizar en medios poco
selectivos como el agar MacConkey o en medios de
cultivo con selectividad media como el agar
Salmonella-Shigella o agar Hektoen. Todos los
medios se incuban en aerobiosis a 37ºC. Los medios
sólidos deben examinarse a las 24 y 48 horas y el
caldo de enriquecimiento se resiembra a las 24
horas en los medios sólidos mencionados
anteriormente. La identificación bioquímica se debe
complementar con la aglutinación mediante
antisueros polivalentes.
En las formas no complicadas de gastroenteritis
por Salmonella el tratamiento antibiótico no parece
acortar los síntomas ni reduce el estado de portador.
Sin embargo, debido al riesgo de complicaciones, se
indica tratamiento antibiótico en los recién nacidos,
en pacientes de edad avanzada, inmunodeprimidos y
portadores de prótesis vasculares o valvulares. Se
detectan de modo creciente cepas multirresistentes a
los antibióticos, con diversos patrones de resistencia
según el área geográfica estudiada. En nuestra
experiencia, aunque ha tenido lugar un incremento
progresivo en la resistencia al ácido nalidíxico, todos
los aislamientos siguen siendo sensibles a
fluoroquinolonas aplicando los puntos de corte y
criterios de interpretación del CLSI, sin embargo, en
estos casos se deben considerar resistentes a todas
las fluroquinolonas. No obstante, los antibióticos de
elección siguen siendo ciprofloxacino o cotrimoxazol.
4.1.4. Campylobacter spp. El género
Campylobacter se compone de bacilos Gram-
negativos pequeños, ondulados que son móviles por
la presencia de un flagelo polar. Todas las especies
son oxidasa positiva. La mayoría de las especies son
microaerofílicas y ligeramente termófilas, pues
crecen con mayor facilidad a 42ºC que a 37ºC. En la
actualidad se han definido varios grupos en base a
las secuencias del ARNr 16S. El grupo I se
denomina Campylobacterias verdaderas. En el grupo
IA se incluyen las especies termofílicas
enteropatógenas: 1) Campylobacter jejuni, con dos
subespecies: la subespecie jejuni, que es la principal
causante de gastroenteritis y la subespecie doylei; 2)
Campylobacter coli; 3) Campylobacter laridis y 4)
Campylobacter upsaliensis. Campylobacter
upsaliensis es, posiblemente, una causa importante
de gastroenteritis en el ser humano, sin embargo, la
verdadera incidencia de la enfermedad producida por
esta especie se subestima con los métodos
convencionales de cultivo. Entre los factores de
virulencia se han descrito flagelos, adhesinas,
proteínas de invasión, citotoxinas y enterotoxinas.
El síndrome más común ocasionado por las especies
de Campylobacter es la enteritis, con un periodo de
incubación de tres a cinco días, heces líquidas
abundantes y vómitos, deshidratación, fiebre y dolor
abdominal. Si bien Campylobacter no es una causa
frecuente de diarrea del viajero (Tabla 2), se
presenta con una elevada prevalencia como causa
de enteritis en el Sudeste Asiático. Se halla
ampliamente distribuido en el tubo digestivo de
diversos animales, en especial en las aves. La
infección en el hombre se encuentra diseminada en
todos los países.
El diagnóstico se realiza por la identificación del
agente etiológico en las heces del paciente. Se
puede hacer una identificación presuntiva mediante
la visualización del movimiento rápido del
microorganismo en microscopía de campo oscuro o
en contraste de fases. Los medios de cultivo propios
para esta bacteria deben contener sangre o carbón
con el fin de eliminar los radicales tóxicos de oxígeno
y, entre otros, incluyen: medio de Butzler, medio de
Skirrow y medio de Campy BAP, en todos ellos se
adicionan antibióticos para restringir el crecimiento
de la microbiota intestinal. Los cultivos se deben
4
incubar en una atmósfera microaerofílica y una
temperatura de incubación de 42ºC. Necesitan para
crecer un periodo de incubación comprendido entre
48 y 72 horas. La identificación preliminar de las
cepas se basa en la tinción de Gram de las colonias
crecidas en medios selectivos, observándose la
morfología sinusoide y la prueba de la oxidasa.
Además C. jejuni, la especie más frecuentemente
aislada, es hipurato positiva, por lo que la realización
de esta prueba permite diferenciar esta especie del
resto.
La gastroenteritis por Campylobacter es
típicamente una infección autolimitada que se trata
mediante la reposición de los líquidos y electrolitos
que se han perdido. El tratamiento antibiótico se
puede utilizar en los pacientes con infecciones
graves o con sintomatología prolongada.
Campylobacter es sensible a una amplia variedad de
agentes antibacterianos. Eritromicina es el antibiótico
de elección para el tratamiento de las enteritis. La
resistencia a las fluoroquinolonas en los últimos años
ha aumentado de una manera drástica por lo que
actualmente estos agentes antibacterianos son
menos eficaces.
4.1.5. Yersinia spp. El género Yersinia, compuesto
por cocobacilos Gram-negativos no esporulados,
incluye 15 especies con 3 subespecies. De entre
ellas, destacan tres especies invasivas capaces de
resistir la respuesta inmune y producir patología
humana: Yersinia pestis, Yersinia
pseudotuberculosis y Yersinia enterocolitica. Y.
enterocolitica está ampliamente distribuida en la
naturaleza y posee numerosos reservorios animales,
siendo el cerdo la fuente de infección más importante
de las cepas patógenas para el hombre. Puede
causar gastroenteritis aguda, enterocolitis,
linfadenitis mesentérica y/o ileitis terminal,
septicemia y cuadros reactivos como artritis, eritema
nodoso y síndrome de Reiter. En 2005 la incidencia
de yersiniosis en la Unión Europea fue de 2,25 casos
por 100.000 habitantes, con tasas más altas en los
países nórdicos. En España se declararon 327 casos
(0,76/100.000 habitantes). Aunque sin una clara
estacionalidad se producen más casos en verano y
comienzo del otoño, siendo los menores de cinco
años el grupo que registra mayor incidencia.
El diagnóstico microbiológico puede realizarse
mediante cultivo de muestras representativas del
cuadro clínico del paciente. Esta especie crece en
los medios escasa y moderadamente selectivos para
enterobacterias como el agar MacConkey y el agar
Salmonella-Shigella, en los que forma colonias
transparentes, en agar entérico de Hektoen las
colonias son de color salmón porque fermenta la
sacarosa y en agar xilosa-lisina-desoxicolato forma
colonias amarillas por fermentar la xilosa. Al crecer
más lentamente que el resto de las enterobacterias a
37ºC las colonias son muy pequeñas y pueden
pasar desapercibidas. Para mejorar su recuperación
se usan medios selectivos y diferenciales, como el
agar CIN que incorpora cefsulodina, irgasan,
novobiocina y manitol. Los métodos de
enriquecimiento no son rentables para el diagnóstico
de la diarrea, ya que no incrementan
significativamente la recuperación de fenotipos
patógenos de Y. enterocolitica. Se pueden usar para
el diagnóstico de adenitis mesentérica o ileitis
terminal y, con bajo rendimiento, para el diagnóstico
de cuadros reactivos. En estos casos se puede usar
tampón fosfato salino (PBS) 0,15M a pH 7,4,
incubando a 4ºC durante períodos prolongados de
tiempo (14-21 días), realizando subcultivos
semanales.
Esta especie es heterogénea y compleja, de modo
que alberga fenotipos con capacidad patógena junto
a otros carentes de determinantes de patogenicidad.
Por ello no todas las cepas aisladas poseen
significación clínica, lo que hace recomendable
estudiar marcadores epidemiológicos (serotipado,
biotipado, fagotipado) que ayuden a caracterizar el
aislado y su pertenencia, o no, a fenotipos
patógenos. El serotipado es sencillo y parece ser un
buen marcador de virulencia. Aunque existen más de
60 serogrupos, la mayoría de las cepas patógenas
humanas pertenecen a los serogrupos 0:1, 2a, 3,
0:3, 0:5, 27, 0:8 y 0:9. En nuestro país hay un claro
predominio del serogrupo O:3. La clasificación en
biogrupos (1A, 1B, 2, 3, 4, 5) es un método más
lento y laborioso. Las cepas virulentas portan el
plásmido denominado pYV (plasmid for yersinia
virulence), que contiene tres genes yadA, yop y ysc
que intervienen en su patogenia. Los genes inv
(invasión) y ail (attachment invasion locus) son
necesarios para la adherencia y la invasión. Los
serogrupos O:3 y O:9 sintetizan dos ß-lactamasas
cromosómicas que confieren resistencia a
aminopenicilinas, carboxipenicilinas y cefalosporinas
de primera y segunda generación. El serogrupo O:8
suele ser sensible a ampicilina.
4.1.6. Bacillus cereus. Bacillus cereus tiene
reservorio telúrico, se encuentra en la materia
orgánica en descomposición, en la tierra, los
vegetales y el agua. Está integrado por bacilos
aerobios o anaerobios facultativos formadores de
esporas que pueden contaminar los alimentos
crudos o cocidos y elaborados. Se multiplica entre
10ºC y 48ºC, de modo que si los alimentos
contaminados se mantienen a temperatura ambiente
se pueden multiplicar los microorganismos,
produciendo y liberando toxinas que ocasionan
brotes de toxiinfección alimentaria. Existen dos tipos
de enterotoxinas producidas por B. cereus, las
enterotoxinas termolábiles que provocan diarrea
(síndrome diarreico) y las toxinas eméticas, que son
termoestables (síndrome emético). Debido a la
levedad del cuadro y a que la detección
microbiológica de esta bacteria no se realiza
rutinariamente en pacientes con diarrea, la incidencia
real podría ser superior a la estimada.
En medios no selectivos o enriquecidos, como agar
sangre, esta especie forma colonias betahemolíticas,
grandes y planas, con apariencia de vidrio
esmerilado. En los casos de toxiinfección alimentaria
la presencia de microbiota polimicrobiana en las
muestras (heces, vómitos, alimentos) hace
aconsejable el empleo de medios selectivos y
5
diferenciales como manitol-polimixina-yema de
huevo. La polimixina B actúa como agente selectivo,
el carácter diferencial lo confiere la actividad
lecitinasa de B. cereus sobre la yema de huevo y su
incapacidad para catabolizar el manitol. Los medios
se incuban a 37ºC durante 48 horas. El
enriquecimiento previo en caldo de soja triptona con
polimixina impide el cultivo cuantitativo.
El diagnóstico de certeza de toxiinfección por B.
cereus debe hacerse mediante la detección de toxina
en los alimentos y/o en las heces. Hay métodos
comerciales para detectar la enterotoxina que
produce diarrea mediante aglutinación pasiva
reversa por látex o por enzimoinmunoensayo. Estas
técnicas pueden aplicarse en alimentos, en heces y
a aislamientos de B. cereus a partir de cultivo para
determinar su toxigenicidad.
4.1.7. Staphylococcus aureus. Staphylococcus
aureus suele producir brotes de toxiinfección
alimentaria por mecanismo toxigénico. Este
microorganismo produce una gran variedad de
sustancias extracelulares y toxinas. Algunas tienen
una acción enzimática mientras que otras, como las
enterotoxinas y las toxinas del shock tóxico, son
potentes inductores de citocinas que actúan como
superantígenos bacterianos. Alrededor del 50% de
los aislamientos de S. aureus producen
enterotoxinas que pertenecen a cinco tipos
serológicos distintos (A, B, C, D y E),
subdividiéndose el tipo C en tres subtipos (C1, C2 y
C3). Estas enterotoxinas son polipéptidos de entre
20 y 30 KDa, termoestables y resistentes a los
enzimas digestivos, se producen en los alimentos y
se ingieren preformadas. Por ello, aparecen de
forma brusca vómitos y diarrea, tras un periodo de
incubación muy corto (1-6 horas). Como ocurre con
otras toxiinfecciones, su incidencia parece estar
subestimada debido al carácter leve y autolimitado
del proceso y a la falta de confirmación
microbiológica en la mayoría de los casos.
La etiología se confirma mediante la detección de
enterotoxinas en los alimentos sospechosos. Hay
métodos comerciales de detección de antígeno para
realizar este diagnóstico. Uno de ellos detecta las
enterotoxinas A, B, C y D mediante aglutinación
pasiva reversa con partículas de látex y otro
mediante enzimoinmunoensayo. Ambas técnicas
pueden utilizarse en alimentos, heces y en
aislamientos de S. aureus a partir de cultivo para
determinar si son cepas toxigénicas.
4.1.8. Clostridium perfringens. Clostridium
perfringens produce cuatro toxinas diferentes (alfa,
beta, epsilon e iota) y sus cepas se distribuyen en
cinco tipos (A-E) según el tipo de toxina que
produzcan. C. perfringens tipo C puede producir
enteritis necrotizante del intestino delgado por acción
de la toxina beta, que es sensible a tripsina, de modo
que solo se produce clínica si hay déficit de este
enzima. C. perfringens produce sobre todo
toxiinfecciones alimentarias que casi siempre se
asocian con consumo de alimentos cárnicos
almacenados inadecuadamente. C. perfringens tipo
A produce una enterotoxina termolábil citotóxica que
induce un cuadro leve y autolimitado de diarrea
secretora con dolor abdominal. Las esporas, que
contaminan los alimentos, germinan cuando se
calientan y las formas vegetativas se multiplican a
temperatura ambiente hasta alcanzar la dosis
infectante, más de 10
6
unidades formadoras de
colonias por gramo (ufc/gr) de alimento. En el
intestino delgado los microorganismos ingeridos
esporulan y liberan la enterotoxina que se une a un
receptor de membrana induciendo una alteración de
la permeabilidad dependiente del ión calcio que
produce la salida de metabolitos y iones de bajo
peso molecular.
El diagnóstico de la toxiinfección alimentaria por C.
perfringens puede hacerse mediante cultivo
cuantitativo de heces de los pacientes. Recuentos
superiores a 10
6
ufc por gramo de heces sugieren
esta etiología, pero valores similares también pueden
detectarse en personas asintomáticas. Por ello es
preferible realizar cultivos cuantitativos de muestras
de los alimentos implicados. En este caso también
se consideran positivos recuentos superiores a 10
6
ufc por gramo de alimento. No obstante, el método
diagnóstico más seguro es la detección de
enterotoxina en heces, que puede realizarse en
cultivo tisular de células Vero con anticuerpos
neutralizantes para inhibir los efectos citopáticos o
mediante técnicas de detección de antígeno, como
enzimoinmunoensayo o aglutinación pasiva reversa
con látex. Esta última técnica puede realizarse con
heces y con aislamientos de C. perfringens para
determinar si son toxigénicos. La enterotoxina de C.
perfringens es muy estable lo que permite la
conservación de las muestras durante periodos
prolongados de tiempo hasta su estudio. No se
aconseja la detección parcial o total del gen de la
enterotoxina en aislados de C. perfringens mediante
PCR o sondas marcadas ya que su presencia no
implica la capacidad de producir la enterotoxina
durante la esporulación en un ambiente similar al
intestinal, condición imprescindible para producir la
enfermedad.
4.1.9. Vibrio spp. El género Vibrio está constituido
por bacilos Gram-negativos ligeramente curvados,
aerobios y anaerobios facultativos, móviles, catalasa
y oxidasa positivos, que fermentan la glucosa y son
sensibles al compuesto vibriostático O/129 (2,4
diamo-6,7 diisopropilpteridina). Forman parte del
medio ambiente hídrico, marino y fluvial, regulando
su proliferación la temperatura y el grado de
salinidad. El género Vibrio contiene 84 especies de
las que al menos doce son patógenas para el
hombre o han sido aisladas de muestras clínicas.
Aunque la mayoría se asocian a infecciones
gastrointestinales, también pueden producir
patología extraintestinal, sobre todo bacteriemia,
otitis, conjuntivitis e infecciones de piel y tejidos
blandos. La gastroenteritis causada por vibrios
puede ser de tipo colérico o no colérico. La forma
epidémica de cólera, causada por Vibrio cholerae
serogrupos O:1 y O:139, cursa con vómitos y diarrea
líquida secretora muy abundante, con pérdida rápida
de agua y electrolitos que causa una profunda
6
deshidratación. La forma no colérica, producida por
otros serogrupos de V. cholerae, Vibrio
parahaemolyticus, Vibrio hollisae y Vibrio fluvialis,
principalmente, cursa con diarrea acuosa
autolimitada, nauseas, vómitos y dolor abdominal,
sin la gravedad ni el carácter epidémico del cólera.
Se designan colectivamente con el nombre V.
cholerae no O:1, no-O:139 a los microorganismos
análogos a las cepas epidémicas pero que no
aglutinan con los antisueros O:1 ni O:139, reciben
también el apelativo de cepas no epidémicas y
anteriormente se han denominado vibrios no
aglutinables (NAG) y vibrios no coléricos (VNC). Se
han asociado a la producción de casos aislados y
pequeños brotes de diarrea. De distribución
prácticamente mundial, su prevalencia es baja, al
menos en países desarrollados. El mecanismo de
transmisión más importante son los mariscos
contaminados que se consumen crudos. En los
brotes estudiados no se han demostrado infecciones
secundarias o transmisión interhumana.
V. parahaemolyticus es un vibrio marino halófilo
ligado a la producción de toxiinfecciones
alimentarias. Aunque su distribución parece mundial,
el mayor número de casos se produce en zonas
costeras y países que por sus hábitos culinarios o
dietéticos incluyen pescado crudo o crustáceos como
parte importante de su alimentación. En España es
reciente la descripción de toxiinfecciones
alimentarias de esta etiología.
La tolerancia al pH alcalino y un crecimiento rápido
en la superficie de los medios líquidos, propician el
uso para el aislamiento de V. cholerae y otras
especies de caldos de enriquecimiento, como el
agua de peptona alcalina (pH 8,5). Se incuba a 37ºC
durante un máximo de 6-8 horas para evitar la
pérdida de selectividad y el sobrecrecimiento
saprófito. La incubación a 42ºC incrementa
significativamente la recuperación de V. cholerae,
con menor grado de contaminación fecal. La mayoría
de las especies pueden crecer en los medios poco
selectivos utilizados para el aislamiento de
enteropatógenos, como el agar de MacConkey, sin
embargo, el sobrecrecimiento de la microbiota
comensal puede dificultar la detección de las
colonias de vibrios por lo que es recomendable el
empleo del agar selectivo TCBS (tiosulfato-citrato
sales biliares-sacarosa), que además facilita el
aislamiento de V. cholerae, ya que en 18 horas a
37ºC forma colonias amarillas al utilizar la sacarosa.
La identificación bioquímica de V. cholerae se sebe
complementar con la aglutinación en porta con
antisueros específicos de los serogrupos O:1 y
O:139. El serogrupo O:1 se puede serotipar
posteriormente como Inaba u Ogawa con los
antisueros específicos de serotipo. La diferencia
entre los biotipos clásico y eltor de V. cholerae se
realiza con pruebas bioquímicas. Dado que V.
cholerae O:1 y O:139 tienen idénticos genes ctx,
ambos microorganismos pueden identificarse
rápidamente por técnicas de hibridación de colonias
con sondas de ADN. La técnica de reacción en
cadena de la polimerasa se emplea para detectar
secuencias del gen ctx. No obstante, estas técnicas
y otras de tipado intraespecífico o de producción de
toxina colérica pueden realizarse en laboratorios de
referencia tras declarar el caso a la autoridad
sanitaria. En situación de brote epidémico de cólera
todos los casos de diarrea deben controlarse
bacteriológicamente para conocer con exactitud el
número de casos y optimizar el uso de los recursos,
dirigiendo de un modo eficiente la aplicación de las
medidas de control.
La mayor parte de las especies son sensibles a
tetraciclinas, aminoglucósidos, cloranfenicol, ácido
nalidíxico y fluoroquinolonas. V. parahaemolyticus, V.
alginolyticus, V. damsela y V. furnisii son resistentes
a ampicilina y a cefalosporinas de primera
generación.
4.1.10. Aeromonas mesófilas. El grupo de las
Aeromonas mesófilas incluye las especies que
pueden crecer a 37ºC. Su hábitat normal lo
constituyen los ambientes acuáticos con escasa o
baja salinidad. Los alimentos pueden ser otro
vehículo de transmisión importante. La clasificación
del género en especies es particularmente compleja.
A la dificultad para establecer la correcta posición
taxonómica de algunas especies, se une que a un
mismo fenotipo le correspondan genotipos distintos.
Actualmente se acepta la existencia de 23 especies,
alguna de las cuales posee además distintas
subespecies o biovariedades que, con fines
prácticos, se incluyen en tres grandes grupos:
Aeromonas hydrophila complex, Aeromonas caviae
complex y Aeromonas sobria complex. No obstante,
solo cuatro fenoespecies se aislan con una
frecuencia significativa a partir de heces: A.
hydrophila, A. caviae, Aeromonas veronii biovar
sobria y Aeromonas trota.
Las especies incluidas en el grupo de las
Aeromonas mesófilas suelen crecer bien en los
medios de cultivo poco selectivos o enriquecidos
utilizados de forma rutinaria (agar McConkey, agar
sangre). Resulta más compleja su recuperación de
muestras contaminadas o con una importante
microbiota acompañante, como las heces. En
general, las Aeromonas crecen en los medios
utilizados para el aislamiento de otros
enteropatógenos (agar MacConkey y Hektoen), si
bien su morfología coliforme y el carácter lactosa
positivo de hasta un 30% de las cepas, plantean una
dificultad añadida para distinguirlas de otras
bacterias aisladas en muestras fecales. Los medios
selectivos más utilizados para el aislamiento de
Aeromonas de heces son el agar sangre con
ampicilina (ASA-10 µg/ml de ampicilina) y el agar
CIN (agar cefsulodina-irgasan-novobiocina). El
primero se incuba a 37ºC durante 18-24 horas y
permite realizar la detección de la actividad oxidasa
directamente de las colonias y observar la actividad
ß-hemolítica; sin embargo, no es un medio
excesivamente selectivo. Además impide la
recuperación de A. trota, que es sensible a
ampicilina. Una buena alternativa es el medio CIN,
descrito inicialmente para el aislamiento de Y.
enterocolitica de heces, pero en el que crecen
7
ambos géneros bacterianos (Yersinia y Aeromonas).
Este medio en su fórmula original permite el
crecimiento de la mayoría de las especies y, en
algunos estudios, consigue un incremento del 35%
en las tasas de aislamiento. La utilidad de los caldos
de enriquecimiento para el aislamiento de
Aeromonas de heces es una cuestión controvertida.
Se ha comprobado que el empleo de agua
peptonada como caldo de enriquecimiento tan solo
contribuye en un porcentaje no superior al 1% a la
tasa final de aislamientos. Esto hace pensar que los
pacientes con diarrea por Aeromonas eliminan gran
cantidad de microorganismos en sus heces, lo que
permite su fácil detección en los medios de siembra
directa, sin que se precise del enriquecimiento de las
muestras.
Como hemos comentado, la identificación
bioquímica de las especies de Aeromonas es muy
compleja, lo que hace difícil conseguir un protocolo
con pocas pruebas, que sea de fácil realización y
que garantice una identificación correcta. Con el fin
de identificar todas las especies del género de forma
rápida y fiable se ha diseñado un método molecular
basado en el análisis de los patrones de RFLP del
gen ARNr 16S, obtenidos tras digerir el gen con
distintas endonucleasas, que permite identificar las
especies aisladas con mayor frecuencia en muestras
clínicas. Son prácticamente resistentes a la
ampicilina (excepto A. trota), carboxipenicilinas y
cefalosporinas de primera y segunda generación.
Suelen ser sensibles a acilureidopenicilinas,
cefalosporinas de tercera generación,
aminoglicósidos, tetraciclinas, cloranfenicol, co-
trimoxazol y fluoroquinolonas.
La enteropatogenicidad de Aeromonas spp. es aún
controvertida. Se reconocen conjuntos
subespecíficos de cepas que albergan un grupo
particular de genes codificadores de enterotoxinas y
otros determinantes de patogenicidad y que son
enteropatógenos, si bien la investigación rutinaria de
estos caracteres es inabordable en microbiología
clínica. Para no prejuzgar la autoría de la diarrea en
los pacientes en que se aísla de las heces este
grupo de microorganismos podría incluirse en el
informe una nota o comentario en los siguientes
términos: “Las cepas de Aeromonas spp. se han
relacionado con la producción de diarrea, aunque
puede haber cepas que no se comportan como
enteropatógenas”.
4.1.11. Plesiomonas shigelloides. Estos
microorganismos son bacilos Gram-negativos,
móviles, indolígenos y fermentan glucosa e inositol.
Se clasifican dentro de la familia Enterobacteriaceae,
a pesar de ser citocromo oxidasa positivo. Tiene una
amplia distribución y se aíslan en el agua, el suelo y
algunos animales (sobre todo peces y mariscos).
Han sido implicados en brotes de gastroenteritis
asociados al consumo de ostras y pescado crudo y
se han descrito casos de diarrea esporádica,
preferentemente en adultos, sin ninguna asociación
epidemiológica. Además puede producir infecciones
extraintestinales, como sepsis y meningitis, de
elevada mortalidad, afectando generalmente a
pacientes con enfermedades de base. Plesiomonas
shigelloides no forma parte de la microbiota normal
del hombre, por ello, su aislamiento en heces de
pacientes con diarrea, en ausencia de otro
enteropatógeno, debería considerarse significativo,
informando su probable responsabilidad en el
proceso infeccioso.
P. shigelloides crece en la mayoría de los medios
de cultivo poco selectivos utilizados para el
aislamiento de enteropatógenos, como el agar
MacConkey. Se han diseñado algunos medios
selectivos y diferenciales que favorecen su detección
en las heces, como el inositol-verde brillante-sales
biliares; sin embargo, no se aconseja su utilización
rutinaria dada su escasa incidencia. Aunque crece
en caldos de enriquecimiento como agua peptonada
alcalina y caldo tetrationato, estos medios líquidos
sólo se recomiendan para muestras no humanas,
como alimentos. Son resistentes a ampicilina
mientras que suelen ser sensibles a la mayoría de
los antibióticos utilizados habitualmente para otros
enteropatógenos.
4.1.12. Clostridium difficile. Clostridium difficile es
un bacilo Gram-positivo anaerobio y esporulado que
puede causar desde diarrea leve hasta cuadros
graves de colitis pseudomembranosa. Para llevar a
cabo su acción patógena ha de producirse una
reducción de la flora comensal habitual del intestino,
lo que permite un mayor crecimiento de C. difficile, y
la producción de las toxinas A (TcdA) y B (TcdB) que
median su capacidad lesiva. TcdB es una potente
citotoxina, mientras que TcdA es una enterotoxina,
clave en la patogenia. Probablemente, ambas
toxinas actúan de forma sinérgica. En torno a un
20% de los casos de diarrea asociada a antibióticos
y casi todos los casos de colitis pseudomembranosa
están causados por cepas toxigénicas de C. difficile.
Las infecciones son más frecuentes en pacientes
hospitalizados, de edad avanzada, o
inmunodeprimidos, que han recibido tratamiento
antibiótico. Puede aislarse también de las heces en
un 3% de individuos sanos y hasta en el 80% de
niños menores de un año, siendo las
manifestaciones clínicas excepcionales en esta
población, debido, probablemente, a la ausencia a
esta edad en el colon de receptores para las toxinas.
Las cepas de C. difficile asociadas a enfermedad
han de ser toxigénicas y, generalmente, producen
ambas toxinas, aunque hay casos de infección por
cepas productoras sólo de TcdB, cuya frecuencia es
variable según el área estudiada. Desde 1999 se han
comunicado varios brotes graves producidos por
cepas (TcdA-, TcdB+). La cepa prevalente
pertenece, en distintos entornos geográficos, al
ribotipo O17, toxinotipo VIII (A-,B+). La resistencia a
clindamicina mediada por erm(B) es una
característica común en estas cepas, que presentan
una distribución clonal mundial.
Los procedimientos para el diagnósticos de
enfermedad producida por C. difficile pueden
dividirse en tres categorías: a) pruebas para la
detección de sus productos (glutamato
deshidrogenasa, ácidos grasos volátiles, toxinas), b)
8
pruebas para detección de sus genes (ARNr 16S,
tcdA, tcdB) y c) cultivo para aislamiento de cepas
toxigénicas.
Los métodos más usados son los que detectan las
toxinas a partir de heces diarreicas recientes
mediante ensayos de citotoxicidad, cultivo toxigénico
y/o enzimoinmunoensayo. No se recomienda el
análisis de heces sólidas ya que disminuye de modo
importante la sensibilidad y, además, existen
portadores sanos de C. difficile toxigénico. El
procedimiento diagnóstico más sensible es el
denominado cultivo toxigénico, es decir, el ensayo de
citotoxicidad de TcdB en líneas celulares a partir de
aislados de C. difficile obtenidos por cultivo. Sin
embargo, es recomendable realizar a la vez un
ensayo de citotoxicidad directa de las heces ya que
aumenta la sensibilidad de la técnica en un 5% y, de
ser positivo, reduce el tiempo necesario para el
diagnóstico. El ensayo de citotoxicidad se basa en la
detección del efecto citopático específico de la
citotoxina B de C. difficile en fibroblastos humanos,
células MRC-5 o células K-1 de ovario de hámster
chino. El cultivo toxigénico consiste en inocular con
un aislado de C. difficile en un caldo de
enriquecimiento, como caldo de infusión de cerebro y
corazón (BHI), incubarlo en anaerobiosis a 37ºC
durante 24 horas, filtrar el cultivo con un filtro de
membrana, diluir el filtrado, añadir la dilución al
cultivo celular elegido e incubar éste a 37ºC,
haciendo lecturas a las 24 y 48 horas. La
especificidad del efecto citopático se comprueba
realizando el mismo ensayo en paralelo en un cultivo
celular que contenga la antitoxina de TcdB. En el
ensayo de citotoxicidad directa se parte de un filtrado
de la muestra de heces que se procesa de forma
idéntica. Aunque considerado como el método de
referencia, es lento, laborioso, no está bien
estandarizado y requiere disponer de antitoxina y
mantener los cultivos celulares. Puede emplearse
como prueba confirmatoria, pero no es asequible
para los laboratorios convencionales.
El cultivo de las heces puede realizarse en medios
selectivos como el agar fructosa-cicloserina-
cefoxitina (CCFA) o el agar yema de huevo-
cicloserina-cefoxitina (CCEY), o bien, en medios no
selectivos, como el agar sangre para anaerobios,
con un pretratamiento de las heces con alcohol
absoluto durante 30-60 minutos o mediante choque
térmico a 80ºC durante 10 minutos. Tras 24-48 horas
de incubación en anaerobiosis, las colonias son no
hemolíticas, mates, planas, grandes e irregulares, de
color amarillento a grisáceo, su estructura interna
recuerda un mosaico de cristales, huelen a cuadra
debido a la producción de p-cresol y muestran
fluorescencia bajo luz UV. Aunque el cultivo es muy
sensible, es poco específico ya que pueden crecer
cepas no toxigénicas de C. difficile y otros clostridios.
La detección del ARNr 16S de C. difficile tiene el
inconveniente de que también es positiva con cepas
no toxigénicas. La PCR en tiempo real para los
genes tcdA y tcdB es más rápida que los ensayos de
citotoxicidad y detectaría portadores asintomáticos.
Disponemos también de varios
enzimoinmunoensayos comerciales para la
detección de TcdA, TcdB o ambas, que incluyen
pruebas de EIA convencionales y de membrana. La
principal ventaja de estos últimos es la rapidez ya
que se obtienen resultados en 15-30 minutos. Estos
test tienen una buena sensibilidad y especificidad
comparados con el test de citotoxicidad. Las
muestras de heces para detectar toxinas se deben
procesar lo antes posible o almacenarlas a 2-8ºC
durante un máximo de 3 días o a -80ºC. La toxina se
degrada a temperatura ambiente y puede llegar a ser
indetectable transcurridas más de 2 horas de su
recogida.
El procedimiento óptimo para realizar el diagnóstico
de la infección por C. difficile es realizar
simultáneamente la detección de toxinas en heces
mediante EIA y el cultivo en CCFA. En los casos en
los que el resultado de la detección de toxinas sea
negativo y se aíslen colonias de C. difficile hay que
realizar la determinación de la toxigenicidad de la
cepa aislada mediante el test de citotoxicidad o
mediante EIA. El cultivo y la investigación de la
producción de toxina del aislado incrementa el
resultado positivo de infección por C. difficile en torno
a un 10%, mejorando la seguridad y la fiabilidad del
diagnóstico.
A comienzos de los años 2000 se detecta la
propagación en hospitales de Estados Unidos y
Canadá de una cepa hipervirulenta de C. difficile,
ribotipo O27 y toxinotipo III, que es resistente a
fluoroquinolonas, produce la toxina binaria CDT y
tiene una delección parcial del gen regulador tcdC
que incrementa notablemente la producción de las
toxinas A y B, y con ello, la gravedad, la mortalidad,
las complicaciones y el riesgo de recaídas. Esta
cepa se ha detectado ya en diversos países
europeos por lo que parece conveniente incorporar
su detección al esquema diagnóstico, lo que puede
concretarse en cultivar las heces, al menos las
muestras que han sido positivas para la investigación
de toxinas, y conservar las cepas de aislados
toxigénicos para su tipado y caracterización
posterior.
4.2. VIRUS
El diagnóstico de las infecciones víricas
intestinales se basa en métodos directos,
consistentes en la detección en la muestra de heces
del paciente de partículas víricas, antígenos o ácidos
nucleicos del virus implicado en la etiología del
cuadro de gastroenteritis. Los métodos serológicos
tienen utilidad en estudios de seroprevalencia o de
análisis de la respuesta inmunitaria, como en el
estudio de seroconversión en niños vacunados frente
a rotavirus. En la tabla 4 se indica una relación de
diversas técnicas comercializadas para el
diagnóstico de infecciones producidas por virus
entéricos.
2
Tabla 4. Relación de técnicas comercializadas para el diagnóstico de infecciones por virus entéricos
Técnicas de inmunocromatografía para rotavirus / adenovirus
Combi-Strip (Coris Bioconcept)
GastroVir-Strip (Coris Bioconcept)
Biorapid Rota/Adeno (Biokit)
Simple Rota-Adeno (Operón)
Combo-Strip (Real)
Rotascreen® Dipstick (Microgen Bioproducts)
Diarlex Rota-Adeno (Orion Diagnóstica)
VIKIA Rota-Adeno (bioMérieux)
RIDA® Quick Rotavirus/Adenovirus Combi (r-Biopharm)
Rotavirus CerTest – sólo rotavirus
Rota-Strip (Coris Bioconcept) – sólo rotavirus
EIA rotavirus
IDEIA® Rotavirus (Oxoid)
Premier
TM
Rotaclone® (Meridian Bioscience)
Pathfinder Rotavirus EIA (Bio-Rad)
RIDASCREEN Rotavirus R-Biopharm
VIDAS Rotavirus (BioMérieux)
Rotascreen® EIA, (Microgen Bioproducts)
EIA de membrana
InmunoCard Stat! Rotavirus (Meridian Bioscience)
ImmunoCard Stat! Adenovirus (Meridian Bioscience)
Aglutinación con látex
Slide Adenokit-Slide Rotakit (bioMérieux)
Rotagen (Biokit)
Adenogen (BioKit)
Rotascreen® Latex (Microgen Bioproducts)
Diarlex Rota-Adeno (Orion Diagnóstica)
Pastorex Rotavirus (Bio-Rad)
Técnicas de inmunocromatografía para astrovirus
Astrovirus CerTest Biotec
EIA astrovirus
IDEIA® Astrovirus (Oxoid)
EIA norovirus
RIDASCREEN ® Norovirus (R-Biopharm)
IDEIA® Norovirus (Oxoid)
EIA adenovirus
Adenovirus RIDASCREEN (R-Biopharm, UK)
Premier Adenoclone – Types 40/41 EIA (Meridian Bioscience)
La causa más frecuente de gastroenteritis víricas la constituyen los rotavirus del grupo A, principales agentes etiológicos de
gastroenteritis infantiles. Otros virus productores de estas infecciones son los astrovirus, adenovirus entéricos, calicivirus
(norovirus y sapovirus), además de otros agentes con una prevalencia menor o desconocida, como coronavirus, torovirus,
picobirnavirus, kobuvirus (virus Aichi), bocavirus, etc.
1
4.2.1. Aislamiento de virus en cultivos celulares.
Los virus entéricos resultan difíciles de aislar en
cultivos celulares, pudiéndose sólo lograr el cultivo
de algunos de ellos. Algunas cepas clínicas de
rotavirus del grupo A se pueden cultivar en líneas
celulares continuas de riñón de mono MA104, en
células LLC-MK2 o en células Caco-2 de
adenocarcinoma de colon. Los astrovirus pueden
también cultivarse en células Caco-2, si bien con
frecuencia es necesario realizar pases ciegos. En
ambos casos es recomendable suplementar el medio
de cultivo celular con tripsina (1 a 10 µg/ml). Otros
virus entéricos (norovirus, sapovirus, picobirnavirus)
no se han logrado replicar in vitro de forma estable, a
pesar de los numerosos intentos realizados, o lo
hacen con dificultad (adenovirus entéricos serotipos
40 y 41 en fibroblastos de pulmón Graham 293). Por
todo ello, en general el aislamiento en cultivo no es
un procedimiento aplicable al diagnóstico de rutina
de las gastroenteritis víricas.
4.2.2. Microscopía electrónica. La microscopía
electrónica (M.E.) de transmisión, así como la
inmunomicroscopía electrónica (I.M.E.), continúa
siendo una técnica de gran valor en el diagnóstico de
las infecciones víricas intestinales, principalmente
porque permite detectar cualquier tipo de partículas
víricas presentes en la muestra, sin necesidad de
recurrir al empleo de “sondas específicas”
(anticuerpos, cebadores, etc.). Es una técnica rápida
que no requiere un procesamiento complejo de la
muestra; sus limitaciones más importantes son la
necesidad de disponer de un microscopio
electrónico, de personal experimentado y la relativa
baja sensibilidad de las técnicas de tinción negativa
habitualmente empleadas, ya que se considera que
se requiere la presencia de más 10
6
partículas
víricas por gramo de muestra para que puedan ser
visualizadas al microscopio electrónico. Aunque
muchos virus entéricos se excretan en las heces en
el curso de la infección en cantidades de 10
11
-10
12
partículas víricas por gramo, se recomienda
concentrar la muestra para observarla al microscopio
electrónico. La muestra de heces se resuspende al
10-20% en tampón fosfato salino y posteriormente se
clarifica por centrifugación a 3.000 rpm durante 15
minutos. El sobrenadante de somete a
ultracentrifugación a 50.000 rpm durante 90 minutos,
o como alternativa se precipitan las partículas víricas
con sulfato amónico (30% p/v) a 4ºC durante 1 hora
y posterior centrifugación a 15.000 rpm durante 15
minutos. El sedimento obtenido se deposita sobre
una rejilla de cobre de microscopía electrónica (400-
mesh) recubierta con una membrana de Formvar
carbonada, donde se lava con PBS y se tiñe con una
solución al 2% de ácido fosfotúngstico a pH 6,3.
Las rejillas se observan a 60 kV a 20.000-50.000
aumentos. La identificación de las partículas víricas
se realiza atendiendo a las características
morfológicas (tamaño, simetría, contorno, estructuras
internas, etc.), resultando fácil la identificación de
rotavirus y adenovirus, y algo más compleja la de
astrovirus y calicivirus (sapovirus y norovirus). Es
posible la identificación de otros virus implicados en
la producción de gastroenteritis, como coronavirus,
torovirus, etc., así como otros virus presentes en las
heces (enterovirus, bacteriófagos, etc.).
4.2.3. Técnicas de detección de antígenos
víricos. Los métodos más asequibles y rápidos, y a
la vez suficientemente sensibles y específicos en el
diagnóstico de las infecciones víricas intestinales son
los métodos inmunológicos que permiten la
detección de antígenos víricos en las heces. Estos
son los métodos más empleados por la mayoría de
los laboratorios. En la actualidad se dispone de
métodos de inmunocromatografía, técnicas de
enzimoinmunoanálisis (EIA) convencional, técnicas
de EIA de membrana y técnicas de aglutinación de
partículas de látex para distintos virus entéricos. La
mayoría de los métodos inmunológicos
comercializados para diagnóstico de virus entéricos
se han desarrollado para detectar antígenos de
rotavirus, principalmente la proteína VP6 de la
cápside, y utilizan anticuerpos monoclonales y/o
policlonales.
4.2.4. Rotavirus
4.2.4.1. Detección de antígenos de rotavirus. Existe
una amplia variedad de inmunoensayos
comercializados para la detección de antígenos de
rotavirus del grupo A en las heces, la mayoría de
ellos con valores de sensibilidad y especificidad
superiores al 90%. En una evaluación de las tres
técnicas más habituales de detección de antígeno de
rotavirus, EIA, ICG y aglutinación de partículas de
látex, recogida en el Procedimiento número 19 de los
Procedimientos en Microbiología de la SEIMC (2005)
se establece: a) para la técnica de EIA, sensibilidad
de 96%, especificidad de 99%, VPP de 98% y VPN
de 98%; b) para la técnica de aglutinación,
sensibilidad de 68%, especificidad de 99%, VPP de
96% y VPN de 88%; c) para la ICG, sensibilidad de
98%, especificidad de 96%, VPP de 92% y VPN de
99%.
Las técnicas de EIA convencionales se consideran
los métodos de referencia por su alta sensibilidad y
especificidad, además permiten la realización de
muchas determinaciones simultáneas. Sin embargo,
el tiempo de realización de la técnica es más largo y
se requiere un equipamiento específico
(espectrofotómetro). Debido a que la rapidez en el
diagnóstico es de gran valor en las gastroenteritis
víricas, es recomendable recurrir a un método rápido
como la ICG, un EIA de membrana o la aglutinación
de partículas de látex. No obstante, dado que en
ocasiones la especificidad de estas técnicas no es
elevada, las muestras positivas deberían ser
confirmadas con un ELISA de captura o una técnica
de RT-PCR.
Técnicas de inmunocromatografía. Actualmente
existen comercializadas numerosas técnicas
inmunocromatográficas para la detección de
antígeno de rotavirus sólo o frecuentemente en
combinación con la detección de antígenos de
adenovirus en las heces (Tabla 4). La prueba se
realiza mediante un dispositivo que contiene un
pocillo para dispensar la muestra, donde se mezcla

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