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TRABAJO PRÁCTICO
FUNDAMENTOS DE PRUEBAS BIOQUIMICAS:
Las pruebas bioquímicas permiten determinar las características metabólicas de las
bacterias de objeto de identificación. Algunas son rápidas, ya que evalúan la presencia de
una enzima preformada y su lectura varía entre unos segundos hasta unas pocas horas.
Otras pruebas requieren para su lectura el crecimiento del microorganismo con una
incubación previa de 18 a 48 horas.
Fermentación de la lactosa en Agar McConkey
Fundamento: Es un medio selectivo diferencial que permite determinar si las bacterias
Gramnegativas fermenta o no la lactosa. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el
crecimiento de los Grampositivos. Las colonias de bacterias que fermentan la lactosa son
rosadas y pueden estar rodeadas de una zona de precipitados de sales biliares, el cual es
debido a una caída en el pH por la fermentación de la lactosa. Las colonias que no fermentan
la lactosa permanecen incoloras.
Lectura e interpretación: Las bacterias fermentadoras de lactosas se observan de color
rosado con o sin zona de precipitado alrededor, mientras que las no fermentadoras de lactosa
se observan incoloras o transparentes
Lac +
Lac -
TSI: Agar Tres Azúcares o Triple Azúcares y Hierro.
Fundamento: Este medio se utiliza para determinar la capacidad de los bacilos
gramnegativos para fermentar lactosa, sacarosa y glucosa, así como para determinar su
capacidad de producir H
2
S (ácido sulfúrico) y gas.
El tubo contiene dos cámaras de reacción, en la parte inclinada (pico de flauta) se
fermenta la lactosa y la sacarosa y en la parte profunda se fermenta la glucosa. Se puede
fermentar los tres azucares o uno de ellos lo cual dependerá del microorganismo que se
estudie.
Lectura e interpretación:
• Kalium-kalium K/K: Se observa tubo color rojo, no fermenta ninguno de los azúcares.
• Acido-Acido A/A: Se observa todo el tubo de color amarillo, fermenta la glucosa,
lactosa y sacarosa, con producción o no de gas, la cual se representa con (G) si es
abundante y (g) si es poca.
• Kalium-Acido K/A: Se observa el tubo en la parte inclinada color rojo y amarillo el
fondo, fermenta solo la glucosa, con producción o no de gas, la cual se representa con
(G) si es abundante y (g) si es poca.
• Kalium- Acido K/A+: Se observa el tubo parte inclinada rojo y amarillo el fondo, con
enecrecimiento, fermenta la glucosa, con producción de H
2
S la cual se representa por (+),
con producción o no de gas, la cual se representa con (G) si es abundante y (g) si es poca.
Fermentador glucosa, productor ác. sulfhídrico y de gas.
Fermentador glucosa, lactosa y productor de gas.
LIA: Lisina Hierro Agar.
Fundamento: Es un medio para detectar enzimas que descarboxilan o desaminan la
lisina en bacilos gramnegativos. Adicionalmente detecta enzimas que producen sulfuro de
hidrógeno y gas proveniente de la glucosa.
No existen Enterobacterias que posean las dos enzimas (descarboxilasa y
desaminasa de la lisina) por lo que sólo se tiene que observar, o una de ambas reacciones o
la ausencia de ambas.
Lectura e interpretación:
• Kalium- Kalium K/K: Se observa tubo color violeta, descarboxilación de la lisina con
producción o no de gas, la cual se representa con (G) si es abundante y (g) si es poca. Se
interpreta Lisina Positiva.
• Rojo-Acido R/A: Se observa tubo color rojo superficie y amarillo fondo, desaminación de
la lisina, con producción o no de gas, la cual se representa con (G) si es abundante y (g) si es
poca. Se interpreta Lisina desaminasa.
• Kalium-Kalium K/K+: Se observa tubo color violeta superficie y negro fondo,
descarboxilación de lisina, con producción de H2S la cual se representa por (+), con
producción o no de gas, la cual se representa con (G) si es abundante y (g) si es poca.
• Kalium-Acido K/A: Se observa tubo color violeta en la superficie y amarillo en el fondo,
el color amarillo se debe a la fermentación de glucosa. Puede haber o no producción de gas.
Se interpreta Lisina negativa. Quiere decir que no descarboxilo ni desamino la lisina.
Nota: Es importante diferenciar las diferentes reacciones del tubo de LIA, conocer cuando
el microorganismo es lisina positiva, lisina negativa y lisina desaminasa. Las cuales serán de
mucha utilidad junto con la fermentación de lactosa en el plato de MacConkey para realizar
montaje del resto de bioquímica de identificación.
1. LDC -, NO H2S, PRODUCTORA GAS.
2. LDC + ó -, PRODUCTROA H2S Y GAS.
3. LDC - , NO H2S, PRODUCTORA DE GAS
MIO:Movilidad, Indol, Ornitina.
Fundamento: Es un medio que se utiliza para determinar la presencia de flagelos, así
como las enzimas descarboxilasa de ornitina y triptofanasa. Por lo tanto, sirve para
determinar la movilidad, descarboxilación de la ornitina y producción de indol.
Algunas bacterias poseen flagelos y otras carecen de ellos. Este medio ayuda a
diferenciar las móviles de las no móviles.
Lectura e interpretación: La movilidad se observa por turbidez del medio, si sólo se
observa crecimiento en la estría realizada es negativa. Si la bacteria posee la enzima
triptofanasa, al agregar el reactivo (3 gotas) de Kovac (p-dimetilaminobenzaldehido) o Erlich
se observa un anillo color rosado intenso. La presencia de enzima decarboxilasa de Ornitina,
desdobla la Ornitinaa putrescina, lo que intensifica el color violeta del medio fondo del tubo.
Un viraje del violeta al amarillo se interpreta ornitina negativo.
INDOL:
Pone de manifiesto la presencia de la encima Triptofanasa en nuestras bacterias, si esta
presente degradará el triptofano y liberará al medio Indol, para revelar su presencia
usaremos el reactivo de Kovac; si hay indol se formará un anillo rojo en la superficie,
sino este será amarillo. Para esto sembramos en caldo con triptofano.
Indol+
Indol-
Se realiza una siembra en picadura, y tras incubar 24 h. observamos si se ha producido
crecimiento entorno a la zona inoculada.
Positivo
Negativo
Urea deCrhistensen:
Fundamento: Detecta la presencia de la enzima ureasa. Cuando la bacteria tiene la
enzima, la urea es desdoblada a amonio y CO
2.
El amonio alcaliniza el medio haciendo virar
el indicador al rosado intenso.
Lectura e interpretación: Una color rosado intenso indica reacción positiva, si el
medio conserva su color original de amarillo pálido o un poco más intenso indica reacción
negativa.
Urea -
Urea +
Citrato de Simons:
Fundamento: Determina la capacidad de un microorganismo de utilizar el citrato
como única fuente de carbono.
Lectura e interpretación: Un viraje de color verde al azul marino y crecimiento en la
superficie da una reacción positiva, de lo contrario es negativa
Malonato (caldo malonato fenilalanina):
Fundamento: Evalúa la capacidad del microorganismo de utilizar el malonato como
única fuente de carbono y la desaminación de la fenilalanina, en forma combinada.Las
Enterobacterias no tienen la capacidad enzimática de realizar las dos reacciones
Cit +
Cit -
simultáneamente, por lo que, o se observa la utilización del malonato o la desaminación de
la lisina.
Lectura e interpretación: Un viraje de color verde al azul, da una reacción positiva,
de lo contrario es negativa.
Rojo de Metilo (RM) - VoguesProskauer (VP):
Fundamento:
VP: Capacidad de un microorganismo de producir un producto final neutro, el
acetilmetilcarbinol (acetoína), a partir de la fermentación de la glucosa.
RM: Comprobar la capacidad de un microorganismo de producir y mantener
estables productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa.
Lectura e interpretación:
El RM es positivo si se observa un anillo de color rojo en la superficie del medio al
agregar 2gts de reactivo rojo de metilo.
El VP es positivo si se observa un anillo de color zapote intenso en la superficie del
medio. Al agregar 4gts de KOH al 40% y 6gts de alfa naftol.

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