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Índice
Introducción a la Cromatografía
Cromatografía de capa fina
Objetivos
Tipos de Cromatografía
La cromatografía en capa fina y su aplicación
Método de la Cromatografía:
• Aplicación de la muestra
• Elección del eluyente
• Procedimiento
• Afinidad con respecto a la muestra
• Lectura Final
• Análisis Cualitativo:
• Análisis semi cuantitativo:
• Análisis cuantitativo: 2 métodos.
Funcionamiento de los materiales.
• Tubo capilar
• Vaso de precipitados
• Cubeta
• La placa de celulosa
• Estufa
Sobre el material y el coste
Conclusión
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Introducción a la Cromatografía
¿En qué consiste?
La cromatografía comprende un conjunto de técnicas que tienen como finalidad la
separación de mezclas basándose en la diferente capacidad de interacción de
cada componente en otra sustancia. De forma general, consiste en pasar una fase
móvil (una muestra constituida por una mezcla que contiene el compuesto
deseado en el disolvente) a través de una fase estacionaria fija sólida. La fase
estacionaria retrasa el paso de los componentes de la muestra, de forma que los
componentes la atraviesan a diferentes velocidades y se separan en el tiempo.
Cada uno de los componentes de la mezcla presenta un tiempo característico de
paso por el sistema, denominado tiempo de retención. Cuando el tiempo de
retención del compuesto deseado difiere de los otros componentes de la mezcla,
éste se puede separar mediante la separación cromatográfica.
Fundamento teórico
La separación de los diferentes componentes de una mezcla que se encuentran
en un líquido o gas es el resultado de las diferentes interacciones de los solutos a
medida que se desplazan alrededor o sobre una sustancia líquida o sólida (la fase
estacionaria). Las diversas técnicas para la separación de mezclas complejas se
fundamentan en la diversidad de afinidades de las substancias por un medio móvil
gas o líquido y un medio absorbente estacionario (papel, gelatina, alúmina o sílice)
a través del cual circulan.
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Cromatografía de capa fina
La cromatografía de capa fina es un procedimiento que se utiliza para separar
moléculas relativamente pequeñas. En la biología celular se utiliza frecuentemente
para separar azúcares simples, lípidos, aminoácidos, nucleótidos, metabolitos, y
ocasionalmente para separar cadenas cortas de poli péptidos y ácidos nucleicos.
Al igual que otras cromatografías, consiste de una fase estacionaria y una fase
móvil y el principio es el mismo: la sustancia de interés se adherirá a la fase
estacionaria o se moverá con la fase móvil, viajando una distancia que es
inversamente proporcional a la afinidad por la fase estacionaria.
La Fase Estacionaria es el efecto de retención producido sobre los componentes
de la mezcla por una fase estacionaria, que puede ser sólida o líquida, anclada a
un soporte sólido. Puede ser variada, puede ser de papel, de celulosa o de un gel
de silicato (vidrio molido bien fino) unido a una superficie sólida (una placa de
vidrio, aluminio, plástico o papel). Esta superficie sólida puede ser rígida o flexible.
El tipo de fase estacionaria que se utilice en un experimento dependerá del tipo de
moléculas que se quieran separar. Incluso vienen algunas placas con indicadores
fluorescentes. La fase estacionaria consiste de un solvente que puede ser agua,
un solvente orgánico o una mezcla de ambos.
En cambio, la Fase Móvil es el efecto de desplazamiento ejercido sobre los
componentes de la mezcla por una fase móvil, que puede ser un líquido o un gas,
sobre una fase estacionaria.
Objetivos:
• Conocer y aplicar la técnica de cromatografía en capa fina, C.C.F., sus
características y los factores que en ella intervienen.
• Calcular valores de Rf de varias sustancias.
• Deducir, a través del Rf la relación que existe entre la polaridad de las
sustancias que se analizan y la de los eluyentes utilizados.
• Aplicar la técnica de C.C.F. como criterio de pureza e identificación de las
sustancias.
Tipos de Cromatografía:
Según la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase móvil:
1. Sólido – Líquido: Fase Estacionaria= Sólida y la Fase Móvil= Líquida.
2. Líquido – Líquido: Fase Estacionaria=Líquido anclado a un soporte solido.
3. Líquido – Gas: Fase Estacionaria= Líquido no volátil impregnado en un
sólido y la Fase Móvil= Gas
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4. Sólido – Gas: Fase Estacionaria=Solida y la Fase Móvil= Gas.
Según el tipo de interacción que se establece entre los componentes de la fase
móvil y la fase estacionaria.
a. Absorción: Fase Estacionaria: Sólido polar capaz de adsorber a los
componentes de la mezcla mediantes interacciones de tipo polar
b. Partición: Separación por ≠ solubilidad de los componentes de la mezcla en
las fases estacionaria y móvil, ambas liquidas.
c. Intercambio Iónico: Fase Estacionaria: Sólido con grupos funcionales
ionizables cuya carga se pueden intercambiar con los iones de la fase
móvil.
La cromatografía en capa fina y su aplicación
Hay muchas razones por las que la cromatografía en capa fina debería ser el
principal método de análisis farmacológico:
• Puede utilizarse para la identificación o para el análisis cualitativo y la
determinación semi cuantitativa;
• Es fácil de utilizar (después de un aprendizaje) y rápida;
• Los análisis son reproducibles;
• Los resultados son fiables y precisos (gran especificidad y selectividad, sin
interferencia de los excipientes);
• Los resultados pueden mejorarse mediante la aplicación de ciertos
reactivos de detección, que producen ciertos colores al reaccionar con los
componentes de las formas farmacéuticas;
• Su coste es relativamente bajo;
• No requiere mucha mano de obra;
• Las placas pueden ser cubiertas por los analistas en caso necesario; por
ejemplo, puede prepararse sílicagel de distintos grosores para ciertos
análisis;
• Los puntos finales (componentes eluidos) son fáciles de detectar
visualmente;
• Los resultados (valores y colores de R
f
y R
r
) pueden incluirse fácilmente en
una base de datos apropiada;
• Podría elaborarse un estuche de cromatografía en capa fina para simplificar
el análisis farmacológico por este método;
• Pueden analizarse preparaciones de componentes múltiples (hasta dos o
tres componentes).
Algunas de las desventajas de la cromatografía en capa fina son las siguientes:
• Hay que tener presente la volatilidad de los disolventes cuando se escojan
sistemas de disolventes para su uso en ciertos climas;
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• Algunos disolventes son potencialmente peligrosos para la salud y el medio
ambiente; así, habrá de tenerse cuidado en su elección (por ejemplo,
cloroformo, benceno, éter)
Método de la Cromatografía
Aplicación de la muestra
Los productos a examinar se disolverán, cuando sea posible, en un disolvente
orgánico no polar que tenga un punto de ebullición lo suficientemente bajo para
que se evapore después de la aplicación. Sin embargo a menudo se necesitan
disolventes polares; la mezcla cloroformo: metanol (1:1) es efectiva.
Frecuentemente se emplean disoluciones al 1%, de manera que al aplicar 2 µl
resulta en la carga de 20 µg de producto solido. Muchos reactivos de revelado
llegan a detectar 0.1 µg de material; por eso con esta carga puede llegarse a
observar un 5% de impurezas.
Existen una gran variedad de micropipetas y microjeringuillas para realizar el
proceso de siembra de la muestra a analizar. También pueden usarse tubos
capilares. El proceso de siembra se realiza tocando con la punta del capilar
(micropipeta, jeringuilla, etc.) sobre la placa preparada. Dejando una distancia al
borde inferior de un centímetro aproximadamente. El punto de aplicación de la
muestra se denomina toque.
Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de forma que
en la placa solo quedará la muestra a analizar.
Elección del eluyente
La elección del eluyente dependerá lógicamente del componente que se va a
separa y del material en que la separación se lleva a cabo.
Principales eluyentes en orden creciente de polaridad:
• Éter de petróleo
• Éter di etílico
• Ciclohexano
• Acetato de etilo
• Tetracloruro de carbono*
• Piridina
• Benceno*
• Etanol
• Cloroformo*
• Metanol
• Diclorometano
• Agua
• Ácido acético
*Compuestos Cancerígenos.
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En la elección del eluyente influyen varios factores:
• Precio
• Pureza
• No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad)
• No utilizar compuestos muy volatiles
• Evitar que contengan trozos de metales (catalizadores)
La elección del eluyente se realiza de forma empírica. Hay que estudiar la
polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez menos polares.
a) Toque de la muestra sin aplicar ningún eluyente
b) Aplicando un eluyente poco polar
c) Aplicando un eluyente más polar
Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares, podemos seguir utilizando la
misma placa para aplicar otros eluyentes más polares, hasta dar con el más
apropiado.
Otra técnica para realizar la elección del eluyente consiste en sembrar varias
muestras distanciadas suficientemente, y aplicar con un tubo capilar distintos
eluyentes sobre el centro de cada muestra. Esto permite desarrollar cada eluyente
radialmente por capilaridad, de forma que se aprecie el eluyente con el cual la
separación se realiza de una manera más eficaz.
Procedimiento:
1. Según las condiciones operativas de cada metodología, se puede necesitar un
tratamiento previo de la placa, o no. Puede tratarse de:
• Activación dentro de la estufa a 120º C durante 30 minutos para eliminar
toda el agua adsorbida.
• Limpieza previa para eliminar impurezas, haciendo ascender por la placa el
mismo sistema eluyente que se utilizará en la cromatografía, pero sin haber
sembrado las muestras.
2. Preparación del sistema eluyente en las proporciones indicadas. Acostumbran
a ser suficientes entre 25 y 50 ml en total. Se introduce en la cubeta, de
manera que el nivel del líquido no quede por encima de 1 cm de altura. Si
hace falta, se vierte una cantidad controlada del eluyente dentro de la cubeta
tapada, durante un tiempo determinado, para que tenga lugar el equilibrio
entre las fases del líquido y vapor (saturación de la cubeta).
3. Con ayuda de un lápiz se hace una línea a unos 2 cm de uno de los lados de
la placa. Ésta será la línea de base sobre la cual se sembrarán todas las
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preparaciones. Se marca también un número de referencia para cada muestra
y para cada patrón.
4. Se procede al sembrado de muestras. Con la ayuda de una micropipeta
capilar se deposita la cantidad estimada de cada muestra y patrón.
Normalmente se utilizan entre 1 y 10 microlitros. Para que el área de la
mancha no sea demasiado grande, es preferible hacer deposiciones sucesivas
de 1 microlitro, más que 5 microlitros de una vez, por ejemplo.
5. Para favorecer una mejor resolución del proceso cromatográfico, hace falta
que el disolvente con el que hemos preparado muestras y patrones, se
evapore totalmente antes de iniciar la cromatografía. Podemos forzar esta
evaporación con un secador de aire. No obstante, hay que ir con cuidado y no
transmitir demasiado calor a las muestras.
6. Se introduce la placa, dentro de la cubeta, teniendo en cuenta que no hay que
tenerla destapada más tiempo de lo estrictamente necesario. Se deja que el
eluyente ascienda por la placa hasta una altura tal que falten 1 o 2 cm para
llegar al extremo superior. O si ya se tiene el tiempo controlado, se deja
transcurrir el tiempo que indica el protocolo.
7. Una vez transcurrido el tiempo necesario, se saca la placa de la cubeta y,
antes de que los disolventes se evaporen, se marca la línea dónde ha llegado
el frente del sistema eluyente. Se deja acabar de evaporar a temperatura
ambiental, hasta que la placa esté bien seca.
8. Si los compuestos no son visibles ni con luz natural ni con luz UV, hace falta
hacer un proceso de revelado químico, rociando sobre la placa un producto
revelador. El revelador es una sustancia capaz de reaccionar químicamente
con los compuestos cromatografiados, dando productos de reacción que
adsorben en la zona visible, y por lo tanto presentan color, o en la zona UV,
siendo semillas observables con lámparas de Wood. Este paso es aconsejable
hacerlo en cabinas de extracción de gases y con elementos de protección
personal.
9. Se visualizan los resultados obtenidos, a simple vista o con luz UV. Se
documenta fotográficamente el cromatograma, o gráficamente los resultados
obtenidos.
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Afinidad con respecto a la muestra
Los componentes de la muestras son transportados a través de la fase
estacionaria mediante la fase móvil las sustancias que tienen más afinidad con la
fase estacionaria quedan retenidas y las que tienen menos afinidad son
arrastradas por la fase móvil hacia la parte superior de la placa. Cuando la fase
móvil a recorrido la longitud de la placa requerida esta se retira y se deja secar.
El resultado del proceso cromatografico es el cromatograma, en el cual se pueden
visualizar las diferencias de sustancias que se encuentran en las muestras. Si la
diferentes sustancias son coloreadas aparecen manchas visibles si son incoloras
será necesario determinar su posición mediante una técnica de revelado a partir
de reactivo químico o de un proceso físico.
Lectura Final
1- Una vez transcurrido el tiempo necesario, se saca la placa de la cubeta y, antes
de que los disolventes se evaporen, se marca la línea dónde ha llegado el
frente del sistema eluyente. Se deja acabar de evaporar a temperatura
ambiental, hasta que la placa esté bien seca.
2- Si los compuestos no son visibles ni con luz natural ni con luz UV, hace falta
hacer un proceso de revelado químico, rociando sobre la placa un producto
revelador. El revelador es una sustancia capaz de reaccionar químicamente con
los compuestos cromatografiados, dando productos de reacción que adsorben
en la zona visible, y por lo tanto presentan color, o en la zona UV, siendo
semillas observables con lámparas de Wood. Este paso es aconsejable hacerlo
en cabinas de extracción de gases y con elementos de protección personal.
3- Se visualizan los resultados obtenidos, a simple vista o con luz UV. Se
documenta fotográficamente el cromatograma, o gráficamente, resiguiendo los
spots obtenidos con lápices, en caso de sustancias lábiles o no visibles.
También se puede hacer una documentación numérica, calculando los valores
Rf de cada mancha obtenida, o lo que es lo mismo, de cada componente
cromatografiado.
Análisis Cualitativo:
Comparación entre la altura de migración de la sustancia a identificar y a la altura
de estándar de la sustancia esperada.
La altura de migración es especifica para cada sustancia en condiciones
cromatograficas definidas.
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Análisis semi cuantitativo:
Comparación del tamaño e intensidad de la mancha de la sustancia problema y
las sustancias Patrones de diferentes concentraciones.
El grado de exactitud lo determina el No. de diluciones de los patrones empleados.
Análisis cuantitativo: 2 métodos.
Raspado: Se raspa la mancha de interés y luego con el solvente adecuado se
extrae la sustancia, a continuación se determina la cantidad mediante titulación o
lectura colorimétrica.
Desventaja: Requiere cantidades grandes de la sustancia.
Densitometría: Con un densitómetro se mide la intensidad de la luz reflejada
directamente sobre la placa.
Ventajas: Menor tiempo y trabajo. Buena exactitud y reproductibilidad
El factor de retención:
Es un parámetro característico de cada compuesto. Se define como el cociente
entre la distancia recorrida por el compuesto y la distancia recorrida por el
disolvente. El valor Rf para una mancha determinada se define así:
Rf
i
= Distancia recorrida por cada mancha “y”
Distancia recorrida por el frente del eluyente
Funcionamiento de los materiales
Tubo capilar
El tubo-capilar consiste en un tubo de plástico transparente cerrado por su
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extremo inferior con un tapón. Perpendicularmente al tubo de plástico y en su
parte inferior, se perfora y se introduce un tubo de vidrio de pequeño diámetro, que
hace de capilar a través del cual se descarga la columna de fluido viscoso. Una
regla colocada en su parte exterior o marcas sobre el tubo permiten medir la
altura.
Vaso de precipitados
Un vaso de precipitados es un recipiente cilíndrico de vidrio boro silicado fino que
se utiliza muy comúnmente en el laboratorio, sobre todo, para preparar o calentar
sustancias y traspasar líquidos. Son cilíndricos con un fondo plano; se les
encuentra de varias capacidades, desde 1 ml hasta de varios litros. Normalmente
son de vidrio, de metal o de un plástico en especial y son aquéllos cuyo objetivo es
contener gases o líquidos. Tienen componentes de teflón u otros materiales
resistentes a la corrosión.
Suelen estar graduados, pero esta graduación es inexacta por la misma
naturaleza del artefacto; su forma regular facilita que pequeñas variaciones en la
temperatura o incluso en el vertido pasen desapercibidas en la graduación. Es
recomendable no utilizarlo para medir volúmenes de sustancias, ya que es un
material que se somete a cambios bruscos de temperatura, lo que lo descalibra y
en consecuencia nos entrega una medida errónea de la sustancia.
Cubeta
Una cubeta o cubeta de espectrofotómetro es un pequeño tubo de sección circular
o cuadrada, sellado en un extremo, fabricado en plástico, vidrio o cuarzo
(transparente a la luz ultravioleta) y diseñado para mantener las muestras durante
los experimentos de espectroscopia.1 Las cubetas deben ser tan claras o
transparentes como sea posible, sin impurezas que puedan afectar a una lectura
espectroscópica. Al igual que un tubo de ensayo, una cubeta puede estar abierta a
la atmósfera por la parte superior o tener una tapa para sellarla. También se
puede utilizar Parafilm para sellarla.
La placa de celulosa
Las placas filtrantes de celulosa son el resultado de un gran trabajo en
investigación y desarrollo.
Las largas fibras de celulosa, después de ser expuestas a un tratamiento especial
para obtener fibras delgadas, forman una estructura entrelazada conteniendo un
aditivo pulverulento de diatomea y perlita. Esta estructura compleja forma un
tamiz, con una porosidad de 70 a 85%, que aseguran una gran habilidad para
retener impurezas. La adición de polímeros sintéticos crea, en un ambiente
acuoso, un potencial electrodinámico positivo permitiendo la absorción de finas
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impurezas.
La correcta dosificación, tan buena como una apropiada preparación de todos los
componentes nos permite producir un amplio y completo rango de placas filtrantes
conociendo casi todos los requerimientos del mercado del filtraje. Las placas de
celulosa ayudan a resolver cualquier problema de filtración.
Estufa
Según las condiciones operativas de cada metodología se puede necesitar un
tratamiento previo de la placa, o no puede tratarse de:
• Activación dentro de la estufa a 120º c, durante 30 minutos para eliminar
toda el agua absorbida.
• Limpieza previa para eliminar impureza, haciendo ascender por la placa el
mismo sistema eluyente que se utilizara en la cromatografía, pero sin haber
sobrado la muestra.
Sobre el material y el coste
• Para llevar a cabo un análisis TLC, básicamente, aparte de los disolventes
y productos químicos, hacen falta las placas cromatográficas.
• Existen muchísimas referencias de placas en el mercado, según las
medidas, naturaleza del soporte (vidrio, plástico o aluminio), tipo y
características del adsorbente, marca comercial, etc. Cada método siempre
detalla la referencia concreta de placa utilizada.
• Otro elemento imprescindible es la cubeta de desarrollo cromatográfico.
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→Debe cumplir dos requisitos mínimos:
1. que sea de un material inerte (a menudo vidrio)
2. que permita ser cerrada herméticamente.
→Hay cubetas especialmente diseñadas para este uso, que se pueden encontrar
en los distribuidores habituales de material de laboratorio.
• Aparte, hay todo tipo de accesorios que nos facilitan la aplicación de las
metodologías. Van desde las sencillas micro-pipetas capilares, hasta
cabinas de aspiración portátiles.
• Cuando se deben hacer visualizaciones de placas con luz UV, a 254 nm o
366 nm, se puede utilizar una lámpara de Wood o cabinas de visualización
por placas TLC.
Conclusión:
Este trabajo nos pareció interesante por los nuevos conocimientos adquiridos, y
por las nuevas demandas laborales, los cuales piden el conocimiento de estos
métodos analíticos.
Por otra parte, la cromatografía en capa fina presenta una serie de ventajas frente
a otros métodos cromatograficos (en columna, en papel, en fase gaseosa, etc.) ya
que el utillaje que precisa es más simple. El tiempo que necesita para conseguir
las separaciones es mucho menor y la separación es generalmente mejor. Pueden
usarse reveladores corrosivos, que sobre el papel destruirían el cromatograma. El
método es simple y los resultados son fácilmente reproducibles, lo que hace que
sea un método adecuado para fines analíticos.
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