Trabajo Práctico: Informes Casos 1-7 | Introducción a la Biología Celular y Molecular | Doctor en Medicina |

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Estudio de casos - Unidad curricular

BCM

Biología Celular y Molecular 2022

Facultad de Medicina - UDELAR

Informe caso 2 BCM

Grupo 8

Integrantes: Nicole Pignatta, Fabrizio Maiorano, Nicolas Martínez, Andrea

Riera.

Objetivos:

- Conocer las técnicas básicas de biología molecular.

- Estudiar en profundidad las técnicas PCR y Electroforesis.

- Indagar sobre la utilidad de los microsatélites y minisatélites en medicina

forense.

Marco teórico:

En el campo de la biología celular, existen diversas técnicas para el

tratamiento y análisis de moléculas como el ADN, ARN o proteínas. Para el estudio

de las primeras podemos identificar tres maneras: la hibridación, la manipulación

enzimática y la síntesis. También se pueden clasificar entre métodos indirectos,

como la electroforesis, y directos, como la secuenciación. [1]

Dentro de las técnicas de síntesis/amplificación, encontramos la técnica de

PCR o reacción en cadena de la polimerasa. La misma tiene como objetivo obtener

numerosa cantidad de copias de un fragmento o gen de interés partiendo de una

pequeña muestra. Para que este proceso se lleve a cabo se necesita una solución

que contenga ADN (gen de interés), cebadores específicos, ADN polimerasa y

desoxirribonucleótidos trifosfato. El proceso comienza con la desnaturalización del

ADN mediante calor (95°C) generando moléculas de ADN de cadena simple, al

bajar la temperatura a unos 55- 65°C pasamos a el alineamiento donde los

cebadores se hibridan con sus respectivas secuencias complementarias en las

cadenas simples generadas anteriormente. Por último tenemos la etapa de

elongación, aquí la temperatura vuelve a subir a unos 72°C y es donde la ADN

polimerasa comienza a sintetizar la nueva cadena complementaria agregando

desoxirribonucleótidos. Este proceso se denomina “in vitro”, para diferenciarlo de la

replicación “in vivo” que sucede naturalmente en el núcleo. [1]

En cuanto a uno de los métodos indirectos para el estudio de las moléculas

previamente mencionadas, se encuentra la electroforesis. Ésta consiste en la

separación de fragmentos de ADN, ARN o proteínas en un gel de agarosa utilizando

un campo eléctrico, las cuales migran según su tamaño y carga neta. Dependiendo

de la carga neta que presentan las moléculas a determinado pH, migrarán hacia el

polo positivo o negativo. Las moléculas de un tamaño grande tienen mayor dificultad

en atravesar el gel, por lo que no migran tanto como las moléculas más pequeñas,

que avanzan más rápido. El poder de resolución está dado por la concentración de

agarosa en el gel, de modo que cuánto más porosa sea, discriminará con mayor

precisión entre fragmentos. [2]

Para poder visualizar a los fragmentos separados, en el caso de los ácidos

nucleicos, se utiliza el CsCl (cloruro de cesio) el cual fluoresce el ADN para que se

vea en la luz ultravioleta y de esa forma poder visualizar y comparar las bandas

obtenidas con el marcador de peso molecular que nos va a indicar cuántos pares de

bases (pb) corresponde con cada banda, éste se agrega en el extremo izquierdo del

gel de agarosa. [2]

Tanto los microsatélites como los minisatélites son secuencias de ADN

repetidas en tándem, es decir, de forma consecutiva. Los primeros consisten en una

secuencia de entre 1 a 13 pb que se repiten en tándem por una longitud de 150 pb

en la mayoría de los casos, mientras que los minisatélites son regiones

relativamente cortas de 1 a 5 kb formadas de 20 a 50 secuencias idénticas repetidas

en tándem, cada una compuesta de 15-100 pb. [3]

Discusión:

Este caso nos presenta un descubrimiento llevado a cabo en 2007 por un

grupo de arqueólogos relacionado con la familia real rusa. El descubrimiento en

cuestión, se trata de un hallazgo de dos cuerpos enterrados a 70 metros de los

restos de la familia previamente mencionada. Se logró identificar que esos cuerpos

correspondían a un niño y una niña.

Para comenzar, se discutieron las diferencias entre la replicación in vitro e in

vivo, siendo la técnica de PCR una replicación artificial. Mientras que en el núcleo

participan una serie de proteínas que forman parte del replisoma, en un PCR sólo se

necesita una, el ADN polimerasa, la cual se encarga de la adición de nucleótidos a

partir del cebador. Las hebras, en vez de ser separadas por tensión, se

desnaturalizan al aumentar la temperatura, lo cuál hace necesario una ADN

polimerasa resistente a estos cambios, como la Taq, la cual es termoestable. Cómo

las hebras se desnaturalizan por completo, tampoco es necesaria la acción de la

helicasa para continuar expandiendo la burbuja de replicación en el núcleo. Otro

proceso que no ocurre “in vitro” es el reemplazo de los cebadores por parte del ADN

polimerasa I.

Con respecto a las utilidades y limitaciones de la técnica, se resaltó la

capacidad de amplificación de segmentos aún en bajas cantidades dentro de una

muestra a gran velocidad, debido a su carácter exponencial. Por otra parte, la

capacidad de crear cebadores específicos requiere del conocimiento sobre las

secuencias de interés, lo cual presenta una limitación ante secuencias

desconocidas.

Luego, centramos las discusiones en la electroforesis, proceso utilizado en

el caso para analizar el ADN de los niños encontrados y determinar si hay

parentesco o no entre ellos y la familia real rusa.

Para establecer un parentesco a partir de las muestras de ADN de los cadáveres

hallados con la familia zarista, se utilizaron los microsatélites TH01 y D7S820. La

razón por la cual se utilizan los microsatélites es su polimorfismo génico, lo que los

convierte en una herramienta excelente para la identificación, por lo que se los llama

las huellas dactilares de ADN.

Para esto se compara las longitudes de las regiones repetidas entre

individuos. Este análisis se hace combinando las técnicas de PCR y electroforesis.

Una vez amplificados por PCR y comparados sus pesos moleculares mediante

electroforesis, se llega a los datos presentados en la tabla del caso (Anexo imagen

1).

Si observamos los datos, la cantidad de pb de los cadáveres coincide en

cada oportunidad con un progenitor del que lo habría heredado. Por ejemplo, la niña

encontrada tiene un microsatélite TH01 de 7pb y otro de 8, al igual que el Zar

Nicolaii II y la Zarina Alexandra, respectivamente. Se deduce, por tanto, que

estaban relacionados. Nótese además que tanto el Zar Nicolai II y la Zarina

Alexandra comparten un alelo del microsatélite D7S820 lo cual indica que existe una

relación de parentesco entre los zares. En la electroforesis se puede ver esto en la

altura de los fragmentos de ADN, que migran al campo positivo ya que los grupos

fosfato le dan una carga neta negativa.

Conclusión:

En resumen, se fueron desarrollando diferentes técnicas para el análisis de

moléculas, ya sea por análisis directo o indirecto. Una de las utilidades del estudio

del ADN es en la medicina forense, usualmente tomando como punto de partida los

microsatélites, debido a su polimorfismo genético. Es posible comparar por

electroforesis, una vez amplificado por PCR, los pesos moleculares de estos para

determinar un parentesco. A partir de este procedimiento, se pudo verificar que los

cuerpos hallados correspondían a los miembros desaparecidos de la familia rusa.

Bibliografía:

1. Genética. Griffiths, Wessler, Lewontin y Carroll. 9a. Edición. McGraw-Hill

Interamericana de España S.L 2008.

2. Biología Molecular de la célula. Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis J.; Raff

M.; Roberts K. y Walter P.: 4° ed. Editorial Omega. 2004.

3. Lodish A, Berk A, Matsudaira P, Kaiser C, Krieger M, Scott M, Zipursky S,

Darnell J. Biología Celular y Molecular. 5ª edición. Buenos Aires,

Argentina: EDITORIAL MEDICA panamericana; 2004.

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