Fisiología - Guía de Trabajos Prácticos - 2019
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SANGRE
TP N 6 - HEMOSTASIA
6.1. TEMARIO: Hemostasia. Definición. Hemostasia primaria. Hemostasia
secundaria. Papel de la vasoconstricción. Reacción plaquetaria. Coagulación de
la sangre. Factores de la coagulación. Vías intrínseca y extrínseca. Factores
dependientes de la vitamina K. Papel del Ca
2+
en la coagulación.
Anticoagulantes "in vivo" e "in vitro". Pruebas de laboratorio. Valores normales e
interpretación. Trastornos de la coagulación. Fibrinólisis. Equilibrio hemostático.
6.2. OBJETIVOS: luego de realizar las experiencias propuestas, Ud. deberá
estar en condiciones de
a) describir los principios básicos de la hemostasia y sus etapas.
b) describir las vías de la coagulación sanguínea, y los factores y mecanismos
involucrados en cada una de sus etapas.
c) describir los fundamentos y la utilidad de cada una de las pruebas de
laboratorio.
d) interpretar y evaluar críticamente los valores obtenidos en cada una de las
pruebas.
e) deducir las causas de los trastornos de la coagulación.
f) describir de qué manera se produce el equilibrio hemostático.
6.3. INTRODUCCION
La hemostasia comprende una serie compleja de fenómenos biológicos que
se producen inmediatamente después de la lesión de un vaso sanguíneo y
cuya finalidad es la detención de la hemorragia. El organismo dispone de un
sistema que balancea las acciones procoagulantes y anticoagulantes y que
permite, según las circunstancias, la detención de la hemorragia y el
mantenimiento de la fluidez de la sangre.
El proceso de la hemostasia se divide en dos etapas: la hemostasia primaria
y hemostasia secundaria. La primera, más rápida, incluye dos fenómenos
fisiológicos que tienen efectos temporarios: 1) la vasoconstricción y 2) la
formación del tapón plaquetario. La segunda etapa, la hemostasia
secundaria, comprende el mecanismo de la coagulación sanguínea, con
mantenimiento del tapón hemostático hasta la cicatrización completa de la
lesión por desarrollo de tejido conectivo. En el transcurso de la cicatrización, el
tapón hemostático es resorbido produciéndose la lisis del coágulo mediante la
fibrinólisis. El esquema 1 muestra el proceso de formación del tapón
hemostático.
6.3.1. Vasoconstricción
La vasoconstricción es causada por la contracción del músculo liso de la pared
del vaso lesionado resultando en la disminucuón del flujo sanguíneo.
Aparentemente, esta reacción se produce por dos mecanismos: a) el espasmo
neurogénico, que es una respuesta refleja autonómica que dura de 10 a 30 s,
y b) el espasmo miogénico, que es una respuesta local directa del músculo que
continúa durante casi 1 h. Además, las plaquetas sanguíneas liberan sustancias
vasoactivas, como la serotonina y el tromboxano A
2
(TXA
2
), que contribuirían a
la respuesta vascular. Esta reacción vascular es efectiva cuando el vaso
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lesionado es de pequeño calibre. Otros agentes capaces de afectar la pared
vascular pueden ser generados durante el proceso de la coagulación. La
activación del factor XII induce la aparición de bradicinina, que aumenta la
permeabilidad vascular y produce vasoconstricción. El fibrinopéptido B, liberado
del fibrinógeno por acción de la trombina, también produce vasoconstricción
directa o indirectamente.
Esquema 1
lesión vascular
coagulación
vasoconstricción exposición del
subendotelio
adhesión plaquetaria
cambio de forma
agregación primaria
reacción de liberación
ADP , TXA
2
,
serotonina, endo-
peróxidos cíclicos,
etc. agregación secundaria
trombina
tapón plaquetario
tapón hemostático fibrina
6.3.2. Formación del tapón plaquetario
Las plaquetas son elementos figurados de la sangre, anucleados, que se
originan de los megacariocitos de la médula ósea, tienen forma discoide y se
mantienen viables en la sangre durante aproximadamente 10 días. Esta forma
característica se pierde cuando participan en el proceso hemostático, entonces,
se observa que presentan prolongaciones desde su superficie (seudopodios) y
aumentan de volumen para transformarse en esferas espinosas.
Las plaquetas tienen gran actividad metabólica y están rodeadas de una
atmósfera plasmática, o periplaquetaria, rica en algunos factores plasmáticos
de la coagulación (I, V, VIII, XI y XIII). En su interior poseen gránulos que
contienen: Ca
2+
, ADP, ATP, serotonina. En las plaquetas se encuentran los
siguientes factores plaquetarios específicos: FP-1 (que actúa como el Factor V
plasmático), FP-2 (Acelerador de la Trombina), FP-3 (fosfolípido plaquetario),
Trombostenina (pro-contráctil, que interviene en la retracción del coágulo),
PDGF (factor de crecimiento derivado de las plaquetas, una proteína que induce
la proliferación de los fibroblastos y las células musculares lisas), FvW (Factor
de von Willebrand, necesario para la etapa de adhesión plaquetaria) y la
2
-
Antiplasmina. Además, posee prostaglandinas como el TXA
2
, endoperóxidos
cíclicos y la PGE
2
. En su membrana está presente el FP-4, (o protamina, que es
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una proteína que neutraliza la acción anticoagulante de la heparina).
Como consecuencia, las plaquetas desempeñan varios roles: participan en la
vasoconstricción, forman el tapón plaquetario a nivel del sitio de lesión y brindan
actividad procoagulante para la formación de fibrina. Por lo tanto, participan en
la iniciación de la hemostasia y en la localización y mantenimiento de las
reacciones enzimáticas de la cascada de la coagulación.
La reacción plaquetaria se produce en el lapso de 3 a 5 s, e incluye una
reacción en cadena de cinco pasos secuenciales:
1. Contacto con la pared del vaso lesionado.
2. Adhesión al tejido conectivo subendotelial que ocurre por interacción
de las plaquetas con el colágeno y las microfibrillas asociadas con
elastina, y por la presencia del FvW plasmático.
3. Extensión, o cambio de forma de las plaquetas, proyectando
seudopodios para cubrir la superficie lesionada.
4. Liberación de compuestos químicos contenidos en los gránulos y el
citoplasma.
5. Agregación de muchas plaquetas para formar una barrera efectiva
contra una pérdida adicional de sangre. En este paso ha adquirido
recientemente importancia una función del fibrinógeno, independiente
de su contribución a la formación de fibrina, que consiste en su unión
a un receptor plaquetario, la glicoproteína IIbIIIa, formando una red
que adhiere las plaquetas activadas entre sí, contribuyendo así a la
formación del tapón plaquetario.
El ADP liberado por las plaquetas constituye la señal de agregación para
otras plaquetas. Su liberación está regulada localmente por la acción de dos
prostaglandinas que derivan del ácido araquidónico, constituyente normal de las
membranas celulares, que son el TXA
2
de las plaquetas y la prostaglandina I
2
, o
prostaciclina (PGI
2
) del endotelio vascular, que ejercen efectos opuestos. El
TXA
2
produce vasoconstricción e incrementa la liberación de ADP y, por lo
tanto, también la agregación plaquetaria. Por el contrario, la PGI
2
produce
vasodilatación, diminuye la liberación de ADP y la agregación plaquetaria,
evitando la formación de trombos. El endotelio vascular también sintetiza y libera
óxido nítrico (NO) que tiene actividad antiagregante. De esta manera, las células
del endotelio vascular evitan que la agregación plaquetaria se extienda más allá
del área de lesión. El resultado de esta interacción plaquetas-pared vascular es
un equilibrio proporcionado por la síntesis de las dos prostaglandinas dando
como resultado una hemostasia adecuada. Los inhibidores de la síntesis de
TXA
2
, como la aspirina, inhiben la agregación plaquetaria. La disminución de la
síntesis o de la liberación de alguno de los componentes proagregantes puede
originar manifestaciones hemorrágicas.
La acción del TXA
2
y de la PGI
2
sobre la agregación plaquetaria se ejerce por
medio de la actividad de la adenilatociclasa y del nivel intracelular de AMP cíclico
(AMPc). La PGI
2
estimula la enzima e induce un aumento de la concentración
intracelular de AMPc que produce disminución del Ca
2+
citosólico y, en
consecuencia, la inhibición de la síntesis de TXA
2
y de la agregación plaquetaria.
Por el contrario, las sustancias proagregantes inhiben la síntesis de AMPc que
produce aumento de la liberación de Ca
2+
de los depósitos intracelulares, la
activación de la fosfolipasa A
2
plaquetaria y aumento de la síntesis de TXA
2
.
Sobre la superficie del tapón plaquetario inestable se exponen: a) el
fosfolípido plaquetario (FP-3), que se expresa solamente después de la
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estimulación de las plaquetas y es el lugar donde se congregan las proteínas
de la coagulación, y b) la fibrina, que es el producto final de la cascada
enzimática y que provoca la estabilización del tapón plaquetario.
6.3.3. Activación de la cascada de la coagulación
La coagulación de la sangre consiste en la conversión de una proteína soluble
del plasma, el fibrinógeno, en un polímero insoluble, la fibrina, por acción de
una enzima denominada trombina. La fibrina forma una red de fibras elásticas
que consolida el tapón plaquetario y lo transforma en tapón hemostático.
Las proteínas de la coagulación forman una cascada enzimática en la que
pocas moléculas iniciadoras de la coagulación inducen la activación secuencial
de proteínas inactivas (proenzimas) que culmina con la formación de la fibrina.
En la coagulación participan solamente factores plasmáticos y las plaquetas
sanguíneas. Un Comité Internacional estableció una nomenclatura unificada
asignando números romanos a los factores de la coagulación según el orden
cronológico de su descubrimiento:
NUMERO
FACTOR
I
Fibrinógeno
II
Protrombina
III
Fosfolípido
IV
Calcio (Ca
2+
)
V
Proacelerina (factor lábil)
VI
no asignado
VII
Proconvertina (factor estable)
VIII
Antihemofílico A
IX
Christmas - Antihemofílico B
X
Stuart - Prower
XI
Antecedente tromboplastínico del plasma - Antihemofílico C
XII
Hageman
XIII
Estabilizador de la fibrina
Los factores activados se representan mediante su número romano
seguido de la letra a. La mayoría de los factores de la coagulación son proteasas
de serina, enzimas proteolíticas que circulan en forma inactiva y en baja
concentración en el plasma. La activación de los factores XII, XI, IX, X, VII y II
es llevada a cabo por un mecanismo común de pérdida enzimática de una
porción de la molécula de la proenzima. Cada factor activado exhibe una elevada
especificidad para el factor que lo sigue inmediatamente en la cascada. Sólo los
factores V, VIII, XIII y I no son enzimas desdobladoras y su actividad desaparece
durante el proceso de la coagulación. Los factores V y el VIII son factores lábiles,
coenzimas que circulan en forma activa.
El factor limitante para la unión y activación de las proteínas de la
coagulación es una superficie fosfolipídica constituida por el factor plaquetario 3
(FP-3) de la membrana de las plaquetas y la tromboplastina tisular o factor tisular
(FT), liberado de las membranas celulares de los tejidos lesionados. La unión de
las proteasas de la coagulación a estos fosfolípidos se efectúa mediante un
puente de Ca
2+
.
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6.3.3.1. Vías de la coagulación
Como ya se ha indicado, el proceso de coagulación consiste en la
transformación del fibrinógeno, una proteína soluble presente en el plasma, en
filamentos de fibrina que constituyen el verdadero coágulo de color blanco. Es
importante destacar que, exceptuando la contribución de las plaquetas
sanguíneas, los elementos formes de la sangre no intervienen en la coagulación.
La razón por la cual los coágulos sanguíneos son normalmente rojos es que la
red de fibrina aprisiona los elementos formes de la sangre y forma una masa
consistente coloreada por la hemoglobina de los hematíes.
Las reacciones bioquímicas de la cascada de la coagulación que
conducen a la generación de trombina a partir de la protrombina están
mediadas por dos reacciones descriptas como vías intrínseca y extrínseca. La
diferencia entre las dos vías radica en la forma de activación del factor X. Ambas
utilizan una vía final común luego de la activación del factor X.
Vía intrínseca:
Para facilitar la comprensión de la compleja secuencia de reacciones que
ocurren durante el proceso de coagulación por la vía intrínseca se las agrupará
en cinco reacciones básicas, que se muestran en el Esquema 2:
Etapa 1 - Fases iniciales del proceso (fase de contacto)
Comienza con la activación de los factores XII y XI, y de otras proteínas
como la precalicreína y el cininógeno, por el contacto de la sangre con una
superficie diferente del endotelio normal y de las células sanguíneas. Todos los
agentes que pueden activar la fase de contacto tienen carga eléctrica negativa:
a) "in vivo": el colágeno de la superficie interna del vaso con el endotelio
destruido, la membrana basal, las endotoxinas bacterianas, etc., y b) "in vitro": el
vidrio del tubo de ensayo, el caolín, etc. La naturaleza exacta de esta fase de
contacto no es conocida, pero se sabe que las reacciones entre las proteínas no
requieren la presenca de Ca
2+
.
Cuando los factores toman contacto con una superficie electronegativa el
factor XI es activado rápidamente por el factor XIIa. Los individuos con
deficiencia del factor XII, cininógenos y precalicreína no tienen manifestaciones
hemorrágicas.
Etapa 2 - Formación del factor IXa
La superficie de la plaqueta queda comprometida en el paso siguiente de la
cascada porque el factor FP-3 de las plaquetas activadas une los factores de la
coagulación, facilitando su interacción. El precursor del factor IXa es un
zimógeno del plasma y uno de los factores dependientes de la vitamina K. El
factor XIa activa al factor IX en presencia de Ca
2+
. La deficiencia del factor IX
produce la hemofilia B.
Etapa 3 - Formación del factor Xa
El factor Xa deriva de un precursor inactivo, el factor X, que es otro de los
factores dependientes de la vitamina K. Una vez activado, el factor IXa convierte
al factor X en su forma activa (factor Xa) usando al VIII como cofactor, en
presencia del FP-3 y del Ca
2+
. Estos factores forman un complejo multimolecular
sobre la superficie de los fosfolípidos plaquetarios.
El factor VIII está disminuido en el plasma de pacientes con hemofilia A y
también en el síndrome de von Willebrand, que se caracteriza por la deficiencia
del factor FvW que es la proteína transportadora del factor VIII.
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[6]
El factor X puede activarse también por la vía extrínseca como se verá más
adelante.
Etapa 4 - Formación de trombina (factor IIa)
La trombina se genera durante el proceso de coagulación por activación de
su precursor inactivo, la protrombina (factor II) que es otro de los factores
dependientes de la vitamina K. La activación del factor II está mediada por la
acción del complejo formado por el factor Xa, el factor V, los fosfolípidos
plaquetarios (FP-3) o tisular (FT) y el Ca
2+
. El factor V acelera la acción del factor
Xa sobre el factor II dado como resultado la aparición de la trombina.
Como ya se ha dicho, los factores V y VIII que participan en los dos pasos
anteriores son coenzimas, o factores asistentes, y son lábiles.
Etapa 5) Formación de fibrina
La fibrina constituye el producto final de la cascada de la coagulación. La
formación de fibrina se produce en tres fases. Durante la fase proteolítica, la
trombina libera del fibrinógeno (factor I) dos pares de péptidos, y la molécula
remanente del fibrinógeno constituye el monómero de fibrina. En la fase de
polimerización, se produce la agregación de monómeros de fibrina mediante
uniones no covalentes y la aparición de fibrina soluble en soluciones
concentradas de urea. Por último, en la fase de estabilización, el factor XIIIa, que
es una transpeptidasa activada por la trombina, introduce enzimáticamente
uniones covalentes cruzadas en la fibrina polimerizada dando como producto el
coágulo de fibrina insoluble. El déficit del factor XIII impide la cicatrización,
produce hemorragias post-quirúrgicas tardías y aumenta la incidencia de
abortos.
Vía extrínseca
Esta vía se denomina extrínseca porque el factor tisular FT no se origina
en el plasma, sino que es liberado por el tejido dañado, y se inicia por exposición
de la sangre a tejidos lesionados. Por lo tanto, el iniciador de la vía extrínseca es
el FT extravascular. El Esquema 2 muestra los pasos de la cascada de la
coagulación por la vía extrínseca.
La activación del factor X por esta vía involucra la participación del factor FT,
que proporciona una superficie apropiada porque está cargada negativamente y
permite unir tanto al Ca
2+
como al factor VII. El factor VII es otro de los factores
dependientes de la vitamina K que se activa en contacto con el FT. Su activación
se produce por formación de un complejo con el FT y el Ca
2+
.
El complejo formado por el factor VII, el FT y el Ca
2+
es el responsable de la
activación del factor X y del factor IX de la vía intrínseca. Dado que en esta vía
son pocos los pasos enzimáticos, la formación del coágulo de fibrina por la vía
extrínseca demora menos tiempo que por la vía intrínseca.
Papel del Ca
2+
y de la vitamina K en la coagulación
El Ca
2+
une algunas de las proteasas séricas a los fosfolípidos mediante
enlaces electrovalentes. En el esquema de las cascadas de la coagulación por
las vías intrínseca y extrínseca se puede observar que el Ca
2+
participa en
algunos de los pasos enzimáticos, pero no en todos. Esos pasos comprenden
las activaciones de los factores IX, X, VII y II, que son justamente los factores
que se unen a los fosfolípidos plaquetario o tisular.
Esquema 2
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VIA INTRÍNSECA VIA EXTRÍNSECA
XII XIIa
activa
XI XIa
Ca
2+
Ca
2+
activa activa FT
VII
VIII Ca
2+
IXa activa
FP-3
activa
activa
V Ca
2+
Xa II Ca
2+
I
FP-3 FP-3
VÍA FINAL COMÚN
activa
se activa a activa
protrombina (II) trombina (IIa)
fibrinógeno (I) fibrina soluble
(en soln. 4 M de urea)
XIIIa
fibrina insoluble
Estos factores son sintetizados en el hígado, siendo imprescindible la
presencia de la vitamina K, que agrega enzimáticamente un grupo carboxilo (-
COOH) al ácido glutámico, uno de los aminoácidos de estas proteasas séricas.
De esta manera los factores adquieren la carga negativa que les confiere la
capacidad de unirse a los fosfolípidos FP-3, en la superficie plaquetaria, o FT,
en la zona del tejido lesionado, en presencia de Ca
2+
. Esta unión es esencial
para la activación fisiológica de los factores.
Cuando hay carencia de vitamina K, o en caso de tratamiento anticoagulante
con antagonistas de la vitamina K, como los dicumarólicos, estas proteasas
séricas son formadas de manera inadecuada porque no son carboxiladas. En
esta circunstancia, aparecen en el plasma como factores no funcionales,
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incapaces de unirse a los fosfolípidos.
La trombina aumenta la actividad de los factores V y VIII, y activa al factor
XIII.
6.3.3.3. Localización del sitio de la coagulación
Una vez que los factores de la coagulación se activan y producen la fibrina,
su acción queda localizada en el sitio de la lesión por tres mecanismos
principales en los que los factores activados: 1) se diluyen por el flujo sanguíneo,
2) son eliminados por el sistema retículo-endotelial hepático, y 3) son
antagonizados por varias proteínas circulantes, entre las cuales está la
antitrombina 3 (AT-3) producida por el hígado. La AT-3 inhibe a la trombina
(factor IIa) mediante la formación de un complejo estable, el complejo trombina-
antitrombina. Es un inhibidor fisiológico normal, pero de acción lenta, y su acción
anticoagulante es acelerada por la heparina. La AT-3 inhibe también a los
factores XIIa, XIa, IXa, Xa y VIIa porque es un inhibidor plasmático de las
proteasas séricas activas.
6.3.3.4. Anticoagulantes
Los anticoagulantes impiden o postergan la coagulación de la sangre.
Este efecto puede ocurrir tanto "in vivo" como "in vitro", según el compuesto de
que se trate. Los anticoagulantes "in vivo" son la heparina y el dicumarol y
sus derivados:
Heparina
La heparina es un polisacárido conjugado que se encuentra en las células
cebadas pericapilares. Carece de propiedades anticoagulantes inherentes. Para
actuar como anticoagulante necesita la presencia de la AT-3, a la que se une,
causando un cambio en su conformación, que acelera su acción inhibitoria y de
esta manera antagoniza más rápidamente a las proteasas séricas activadas. La
actividad de la heparina depende de niveles plasmáticos adecuados de AT-3, y
la reducción congénita de los niveles de AT-3, si es severa, produce trombosis
fatal. La deficiencia adquirida, por ejemplo, por el uso de anticonceptivos
hormonales, aumenta el depósito de fibrina en los vasos lesionados. La
administración de heparina, para evitar la trombosis intravascular, se realiza por
vía endovenosa. El efecto anticoagulante es inmediato y su antagonista, la
protamina, también actúa de manera inmediata.
Dicumarol y sus derivados
Estos anticoagulantes actúan de manera competitiva con la vitamina K
impidiendo la síntesis hepática adecuada de los factores IX, X, VII y II, los que
son así liberados a la circulación como factores incompletos anómalos, no
funcionales.
Son administrados por vía oral para impedir la trombosis vascular. Su efecto
tarda varias horas en manifestarse porque se debe esperar que decaigan los
niveles de los factores circulantes preexistentes. Para valorar que la dosis es la
adecuada para el paciente, se utiliza la RIN (Razón Internacional Normatizada)
que resulta de dividir el tiempo de protrombina (TP) del paciente en el TP normal.
Para que un sujeto se encuentre anticoagulado, el resultado del cociente debe
ser mayor que 2.
Nuevos anticoagulantes orales
Existen nuevos anticoagulantes, que actúan sobre el factor X activado
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(rivaroxabán y apixabán) o sobre la trombina (dabigatrán). Los inhibidores del
factor Xa impiden la formación de la trombina, mientras que el inhibidor directo
de la trombina bloquea su actividad e impide la conversión de fibrinógeno a
fibrina. El efecto neto de ambos mecanismos es la disminución de la actividad
de la trombina y de la formación de fibrina, lo que supone una inhibición de la
coagulación. La generación de trombina es un elemento clave en este proceso,
porque además de ser el factor causante de la producción de fibrina, es un
potente agonista plaquetario y amplifica su propia generación mediante la
activación de factores de la coagulación, como el factor V, el factor VIII y el factor
XI. Por otra parte, también activa el factor XIII, causante de estabilizar el coágulo
de fibrina.
Son anticoagulantes "in vitro":
Agentes quelantes de Ca
2+
:
Son moléculas orgánicas que secuestran el Ca
2+
e impiden su participación
en la cascada de la coagulación. El oxalato de sodio lo precipita en forma de sal
insoluble (oxalato de Ca
2+
) mientras que el EDTA y el citrato de sodio fijan el
Ca
2+
en forma no ionizada. El uso mundial del citrato de sodio como
anticoagulante en los bancos de sangre fue desarrollado por un argentino, el Dr.
Luis Agote.
Desfibrinación: con varillas de madera o perlas de vidrio sobre los que se
deposita la fibrina.
Tubos siliconados o de plástico: en los que se dificulta la activación de la
coagulación al reducirse el efecto del contacto con superficies cargadas
negativamente.
Frío: La disminución de la temperatura prolonga el tiempo de coagulación.
Sales concentradas: que impiden la formación de la trombina.
Heparina: actúa también como anticoagulante "in vitro" porque la sangre
extraída contiene AT-3, aunque su efecto es temporario porque es metabolizada
por los glóbulos rojos.
6.3.4. PRUEBAS DE LABORATORIO
Las pruebas de laboratorio se dividen en:
A- Las pruebas para detectar alteraciones de la coagulación y diagnosticar su
causa, determinando la deficiencia del factor involucrado, se clasifican en:
Tiempo de coagulación
Globales
Tiempo de coagulación del plasma recalcificado
Vía Intrínseca Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada
Vía Extrínseca Tiempo de Protrombina
Consumo de Protrombina
Parciales
Tiempo de Trombina
(Ninguna de estas pruebas detecta el déficit de factor XIII)
Analíticas Dosaje de Factores
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[10]
B- Las pruebas de laboratorio para el estudio de las funciones vascular y
plaquetaria:
Prueba del lazo o del torniquete
Vascular y plaquetaria
Tiempo de sangría
Recuento de plaquetas
Plaquetarias
Retracción del Coágulo
6.4. PARTE PRÁCTICA
A continuación, se describen e interpretan algunas de las pruebas.
6.4. A- Pruebas de la coagulación sanguínea
6.4.A.1. Tiempo de coagulación
Es el tiempo que transcurre hasta que se forma fibrina en cantidad
suficiente para que una masa de sangre extraída en ausencia de anticoagulante
pase del estado de sol a gel. Esta prueba explora todos los factores de la
coagulación involucrados en la vía intrínseca, con excepción del factor XIII.
El activador de esta prueba es la pared del tubo en el que se introduce la
sangre, y/o de la jeringa, si es de vidrio, que activan a los factores XII y XI.
Las precauciones técnicas a tener en cuenta son:
1. La extracción de la sangre debe ser cuidadosa para evitar la mezcla con
líquidos tisulares (que contienen el FT). Es conveniente usar la técnica de las
dos jeringas, que consiste en extraer con una jeringa unos pocos ml de sangre
que deberán ser desechados, y con otra jeringa (pero con la misma aguja, que
no deberá extraerse de la vena) la sangre que se usará para la prueba. Si se usa
una sola jeringa no se deberá emplear nunca para la prueba los últimos ml de
sangre contenidos en la misma.
2. Se deberá evitar la formación de espuma, que acelera el tiempo de
coagulación.
3. Los tubos destinados a contener la sangre deben estar limpios, ser lisos,
de vidrio, de vidrio siliconado o de plástico, y de diámetro constante.
4. Los movimientos que se ejercen a los tubos aceleran la coagulación. Es
por esto que la prueba debe hacerse por triplicado, utilizando los dos primeros
tubos para hacer la determinación aproximada y el tercero para obtener el tiempo
exacto.
5. La temperatura debe ser de 37°C porque el frío prolonga el tiempo de
coagulación.
Método de Lee-White
En el instante en el que la sangre penetra en la jeringa se debe poner en
marcha el cronómetro. Se coloca l ml de sangre en cada uno de los tres tubos
que se llevan al baño de 37°C. En el primer tubo se observa la sangre, por
inclinación cada 30 s, hasta que la misma deja de escurrir por las paredes.
Entonces se observa del mismo modo el segundo tubo, y se anota como dato
definitivo el valor del tercer tubo.
Valores normales: 5 a 10 min en tubo de vidrio y 25 a 45 min en tubo siliconado
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[11]
Interpretación:
Es una prueba muy poco sensible y no debe usarse como único parámetro de
la función coagulante. Sirve sólo para orientar el diagnóstico de enfermedades
hemorrágicas. Un tiempo de coagulación prolongado resulta significativo,
mientras que un valor normal no permite asegurar que la hemostasia del paciente
sea normal. El tiempo de coagulación está prolongado, por ejemplo, en las
hemofilias.
6.4.A.2. Tiempo de Coagulación del Plasma Recalcificado
Es el tiempo que tarda el plasma descalcificado en formar el coágulo blanco
de fibrina soluble en urea, luego del agregado de Ca
2+
.
Reactivos:
1) Solución de oxalato de sodio 0.1 M.
2) Solución de cloruro de calcio 0.025 M.
3) Plasma oxalatado: se preparan uno o dos tubos de hemólisis (10 ml) y se
coloca en cada uno 0.5 ml de la solución de oxalato de sodio 0.1 M, se agregan
4.5 ml de sangre venosa, se mezclan invirtiendo los tubos y se centrifugan a
1000 rpm durante 5 min para obtener un plasma rico en plaquetas. Se transfiere
cuidadosamente el plasma sobrenadante a otro tubo. Este plasma descalcificado
puede conservarse en la heladera (4°C) para ser utilizado en otras pruebas.
Técnica:
En un tubo de Kahn (5 ml), ubicado en el baño a 37°C, se coloca 0.2
ml de plasma oxalatado, y después de unos minutos se agrega 0.2 ml de CaCl
2
0.025 M. Al mismo tiempo se pone en marcha el cronómetro dejando el tubo
quieto durante 10 s. A partir de ese momento se inclina suavemente el tubo
observando la aparición del gel blanco de fibrina, deteniendo la marcha del
cronómetro que marca el final de la prueba.
Valores normales: oscilan entre 90 y 120 s.
El Tiempo de coagulación del plasma recalcificado es más corto que el tiempo
de coagulación porque en la prueba se excluye el período correspondiente a la
fase de contacto (activación de los factores XII y XI).
Interpretación:
Esta prueba es un poco más sensible que el tiempo de coagulación para la
determinación de los factores que intervienen en la vía intrínseca. El tiempo está
prolongado en individuos hemofílicos.
6.4.A.3. Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada (TTPA) o kaolin partial
thromboplastin time (KPTT)
Mide el tiempo que tarda en coagular el plasma oxalatado en presencia de
una tromboplastina parcial, la cefalina (que sustituye al FP-3), de caolín o celite
(tierra de diatomeas, un activador por contacto), y de Ca
2+
.
Reactivos:
1) Plasma oxalatado, cuya obtención ya fue descripta (ver punto 6.4.A.2).
2) Tromboplastina parcial activada, que se encuentra en el comercio bajo
distintas denominaciones: Thrombofax, Platelin (que además provee celite y un
buffer).
3) CaCl
2
0.025 M.
Técnica:
En un tubo de Kahn se colocan 0.1 ml de Platelin y 0.1 ml del plasma
oxalatado en estudio. Se incuba en el baño a 37°C durante 3 a 5 min. Al cabo
Fisiología - Guía de Trabajos Prácticos - 2019
[12]
de este tiempo se agrega 0.1 ml de CaCl
2
0.025 M, poniendo en marcha
simultáneamente el cronómetro. Se mueve el tubo hasta que se observa la
aparición del coágulo de fibrina y se detiene en ese momento el cronómetro.
Valores normales: oscilan entre 40 y 60 s.
El valor es menor que el tiempo de coagulación del plasma recalcificado
porque la tromboplastina parcial se encuentra disponible en su totalidad y no es
necesario esperar que sea liberada de las plaquetas. Además, el caolín activa
al máximo los factores XII y XI.
Interpretación:
Es una prueba muy sensible a la deficiencia de cualquiera de los factores de
la coagulación que participan en la vía intrínseca. Esta prueba es anormal en
las deficiencias de los factores XII, XI, IX, VIII, X, V, I y II. No detecta
deficiencias del factor III o FP-3 plaquetario porque en la prueba se agrega
como reactivo un factor similar. La prueba es normal en enfermos con deficiencia
del factor VII. Se utiliza para el control y dosificación de la terapia heparínica.
6.4.A.3. Tiempo de Protrombina (TP)
Estudia el mecanismo de la coagulación por la vía extrínseca. Consiste en
determinar el tiempo de coagulación del plasma en presencia de un exceso
de tromboplastina tisular (Simplastin, que contiene además el CaCl
2
necesario
para la prueba).
Método de Quick
Reactivos:
1) Plasma oxalatado (ver punto 6.4.A.2).
2) Tromboplastina tisular (Simplastin).
Técnica:
Se colocan en un tubo de Kahn 0.1 ml de plasma oxalatado y 0.2 ml de
suspensión de tromboplastina tisular con Ca
2+
, se ubica el tubo en el baño a
37°C, se pone en marcha el cronómetro y se agita enérgicamente. Se deja el
tubo quieto durante unos 5 s y a partir de ese intante se lo inclina suavemente
hasta observar el coágulo. Se detiene el cronómetro y se anota el tiempo.
Valores normales:
Se expresan de dos maneras:
a) En tiempo: los valores oscilan entre 12 y 15 s.
b) En contenido porcentual de protrombina:
Para ello es necesario preparar una curva de calibración determinando el
tiempo de protrombina de varias diluciones de una mezcla de plasmas normales
diluidos al 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80 y 100 % en solución isotónica de NaCl.
Se llevan los valores obtenidos a un sistema de coordenadas colocando en la
abscisa los % de las diluciones y en la ordenada los tiempos obtenidos. La
curva indica el contenido porcentual de protrombina con relación al tiempo
determinado. Luego se mide el tiempo de protrombina del plasma problema y
usado la curva de calibración se determina el contenido porcentual de
protrombina.
Interpretación:
Esta prueba es normal en los trastornos de la vía intrínseca y anormal en
enfermos con defectos de los factores VII, X, V, I y II. Es una prueba muy útil
para el control de la terapia con anticoagulantes orales, como los dicumarólicos,
que disminuyen la producción adecuada de los factores II, VII IX y X,
dependientes de la vitamina K, que participan en la vía extrínseca. Valora
Fisiología - Guía de Trabajos Prácticos - 2019
[13]
también el factor V (lábil o proacelerina). No hay hemorragia hasta que la
concentración de protrombina es inferior al 20%.
6.4.A.5. Tiempo de Trombina (TT)
Mide el tiempo de coagulación del plasma después de agregar una solución
estándar de trombina.
Reactivos:
1) Plasma oxalatado (ver punto 6.4.A.2).
2) Solución de trombina.
Técnica:
Se coloca en un tubo de Kahn 0.2 ml de plasma oxalatado y se incuba
durante 2 min en el baño de 37°C al cabo de los cuales se agrega 0.1 ml de
trombina preincubada a 37°C. Se pone en marcha el cronómetro y se observa
la formación del coágulo.
Valor normal: 6 s.
Interpretación:
Un Tiempo de trombina prolongado indica:
a) Un defecto del factor I o fibrinógeno, congénito o por insuficiencia hepática.
Los resultados dependen de la concentración y calidad del fibrinógeno, siendo la
prueba muy sensible a las anomalías moleculares de este factor.
b) Un aumento anormal de la fibrinólisis debido a los productos de
degradación de la fibrina (ver punto 6.5. Fibrinólisis, más adelante).
c) La presencia de antitrombinas.
El Tiempo de Trombina es anormal cuando hay disminución o ausencia de
fibrinógeno (hipofibrinogenemia y afibrinogenemia, respectivamente). Esta
prueba es normal en enfermos con defectos de los factores de la coagulación de
las vías intrínseca y extrínseca, porque no los valora.
6.4.B. Pruebas vasculares y plaquetarias
La concentración de plaquetas en la sangre normal oscila entre 150.000 y
400.000 / mm
3
. Cuando es superior a 40.000/ mm
3
no es común que se
presenten hemorragias espontáneas o después de un traumatismo o lesión.
Cuando la concentración es menor de 10.000/ mm
3
el riesgo de hemorragia
puede ser grave.
6.4.B.1. Prueba del lazo o del torniquete
En esta prueba se somete a los capilares de la piel del antebrazo a un
aumento de presión usando el manguito del tensiómetro, colocado en la parte
superior del brazo, y aplicando una presión intermedia entre la sistólica y la
diastólica, lo que obstruye la circulación venosa de retorno pero permite el flujo
sanguíneo por los capilares. Luego de 5 min se observa el número de petequias,
que aparecen por ruptura de los capilares, en un círculo de 5 cm de diámetro
a 10 cm del pliegue del codo en la cara anterior del antebrazo.
Valor normal: hasta 5 petequias.
Interpretación:
El número de petequias puede estar aumentado tanto en caso de
trombocitopenia y de alteración de la función plaquetaria, como por alteraciones
vasculares causadas por deficiencia de vitamina C.
Para realizar esta prueba es conveniente suspender el consumo de
antiagregantes plaquetarios, como la aspirina, durante por lo menos 5 días antes.
Fisiología - Guía de Trabajos Prácticos - 2019
[14]
6.4.B.2. Tiempo de Sangría
Mide el tiempo necesario para que se produzca la hemostasia espontánea de
una hemorragia causada por una incisión controlada de vasos subcutáneos
pequeños.
Método de Duke
En esta prueba se efectúa una punción con una lanceta en el borde
inferior del lóbulo de la oreja desinfectada con alcohol. Cuando comienza a
manar sangre por la pequeña herida, se pone en marcha el cronómetro y se
secan las gotas de sangre cada 30 s con un papel de filtro. Esta operación se
repite hasta que no fluye más sangre.
Valor normal: entre 1 y 4 min.
Método de Ivy
En esta prueba se coloca alrededor del brazo el manguito del
tensiómetro, con el que se ejerce una presión constante de 40 mm Hg durante
toda la prueba. Se desinfecta la cara anterior del antebrazo con alcohol y con
la lanceta se hacen 3 incisiones. Se pone en marcha el cronómetro y, con
intervalos de 30 s, se seca cuidadosamente cada gota de sangre con su
correspondiente papel de fitro. El punto final está dado por la detención de la
hemorragia. Se toma el promedio de los tres tiempos obtenidos en las tres
punciones.
Valor normal: entre 2 y 7 min.
Interpretación de las pruebas:
En estas pruebas se valoran factores vasculares (vasoconstricción) y celulares
(adhesión y agregación plaquetarias). Los valores están prolongados en
pacientes con alteraciones vasculares, trombocitopenias y alteraciones
funcionales plaquetarias.
6.4.B.3. Retracción del Coágulo
La retracción del coágulo es la contracción espontánea del mismo con
expulsión de un suero claro. Esta retracción depende de la actividad normal de
las plaquetas y de la formación de fibrina. Por lo tanto, si hay disminución
considerable del número de plaquetas o de la concentración plasmática de
fibrinógeno, la retracción se dificulta.
Método cualitativo
Técnica:
Se puede utilizar el tubo en el que se ha practicado la prueba del Tiempo
de coagulación, que se deja a temperatura ambiente durante 4 h, como mínimo.
o en la estufa a 37°C durante 2 h como mínimo. Luego se realiza la observación
del coágulo.
Tipos de coágulos:
1. Normorretráctil: Aproximadamente la mitad de la sangre se escurre como
suero. El coágulo está adherido en su parte superior a todo el contorno de la
pared del tubo.
2. Hiperretráctil: El coágulo es pequeño y corresponde a un tercio o menos
del volumen total de sangre. Este tipo se presenta generalmente en la anemia
por disminución del volumen celular, y puede encontrarse en casos de
trombosis vascular.
3. Hiporretráctil: Puede parecer que no existe retracción, pero se exuda una
Fisiología - Guía de Trabajos Prácticos - 2019
[15]
pequeña cantidad de suero. Puede tratarse de una hiperglobulia, pero en
general corresponde a una disminución del número de plaquetas a
aproximadamente 50.000 a 70.000/mm
3
.
4. Arretráctil: Cuando no se produce retracción del coágulo. Puede coincidir
con un alargamiento del tiempo de coagulación. Se produce cuando está muy
disminuido el recuento de plaquetas.
5. Cruórico: La sangre coagula dejando una zona blanca en su parte superior
("custra flogistica" o "costra inflamatoria") que va cambiando progresivamente
a un coágulo rojo hacia el fondo del tubo. Aparece en diferentes enfermedades
y no tiene un significado preciso. Se puede producir por dos razones: la velocidad
de sedimentación gobular está aumentada o el tiempo de coagulación está
también muy prolongado. El coágulo cruórico puede coincidir con una retracción
normal o alterada.
Método cuantitativo
Se colocan 5 ml de sangre en un tubo graduado en el que se introduce
un alambre enrrollado en la parte inferior. Se lleva el tubo al baño de 37°C,
donde permanece una hora después de la formación del coágulo. El coágulo
queda adherido al alambre, que se retira dejando escurrir el suero dentro del
tubo. Se lee el volumen de suero y se realiza el cálculo para expresar el resultado
en porcentaje de retracción.
Valores normales: oscilan entre 48 y 64 % (promedio 55%).
6.5. FIBRINÓLISIS
La lisis del coágulo es el proceso de disolución del coágulo de fibrina que
puede ser considerado como un mecanismo de defensa esencial contra la
oclusión de los vasos sanguíneos. La lisis prematura de la fibrina puede reiniciar
la hemorragia.
La fibrinólisis se produce por la digestión de la fibrina por acción de la
plasmina, una enzima proteolítica, cuya forma inactiva en el plasma normal es
el plasminógeno.
Los pasos iniciales de la fibrinólisis fisiológica son idénticos a los de la cascada
de la coagulación.
En el primer paso, el plasminógeno es activado a plasmina por tres
mecanismos: intrínseco, extrínseco, y desde el interior del coágulo. El
mecanismo intrínseco es intravascular, más débil que el extrínseco, y se inicia
por el contacto con superficies extrañas, el factor XIIa, y por la acción de la
precalicreína. Esto implica que la coagulación de la sangre y la fibrinólisis están
íntimamente relacionadas por medio de la fase de contacto. El mecanismo
extrínseco de la fibrinólisis se inicia por la acción de activadores tisulares
extravasculares y endoteliales. Además, la trombina inicia la activación de la
fibrinólisis desde el interior del coágulo.
La estreptoquinasa y la uroquinasa son también activadores extrínsecos de la
fibrinólisis La estreptoquinasa no está involucrada en la fibrinólisis fisiológica
sino que es un activador sintetizado por el estreptococo hemolítico. La
uroquinasa es producida por el endotelio del riñón y aparece en la orina. Ambas
son utilizadas en el tratamiento fibrinolítico de la trombosis y del
tromboembolismo.
El segundo paso del sistema lítico es la acción desdobladora de la
plasmina que hidroliza el coágulo de fibrina, el fibrinógeno y los factores V y VIII.
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