RECIENTES AVANCES Y APLICACIONES
DE LA ENZIMA GLUCOSA OXIDASA
INMOVILIZADA POR UNIÓN COVALENTE
TRABAJO FIN DE MÁSTER
Curso: 2019/2020
Alumna: Belén Cacho Salán
Tutor: José Manuel Rodríguez Nogales
Máster en Calidad, Desarrollo e Innovación de Alimentos
E.T.S. Ingenierías Agrarias, Campus de la Yutera (Palencia)
Universidad de Valladolid
Índice
1. Resumen ...…………………..…………………………………………………………. 1
2. Introducción …………………………………………………………………………….. 2
3. Justificación …………………………………………………………………………….. 3
4. Objetivos ...……………………………………………………………………………… 3
5. Material y métodos …………………………………………………………………….. 3
6. Resultados y discusión ….……………………………………………………………. 4
6.1. Aspectos generales de la enzima glucosa oxidasa ……………………………... 4
6.2. Aplicaciones de la enzima glucosa oxidasa en la industria alimentaria ………. 6
6.3. Visión general de los sistemas de inmovilización de enzimas …………………. 8
6.4. Avances en la inmovilización por unión covalente de la enzima glucosa oxidasa
………………………………………………………………………………………… 14
7. Conclusiones …………………………………………………………………………. 22
8. Referencias bibliográficas …………………………………………………………… 23
9. Anexo I ………………………………………………………………………………… 28
1. Resumen
Las enzimas son catalizadores biológicos que desempeñan un papel primordial en
distintos procesos bioquímicos de la industria alimentaria. Una de las enzimas más
utilizadas en este ámbito es la glucosa oxidasa debido, en parte, a sus propiedades
oxidantes al convertir la glucosa en ácido glucónico, consumiendo oxígeno y
produciendo peróxido de hidrógeno. La inmovilización de la glucosa oxidasa se ha
empleado como estrategia para mejorar su actividad y estabilidad y permitiendo
también su reutilización, por lo que permite que los procesos industriales sean más
rentables. Uno de los métodos de inmovilización más destacados es la inmovilización
por unión covalente gracias, principalmente, a que la unión de la enzima con el soporte
es muy estable. En este trabajo se hace una revisión bibliográfica de los avances
recientes en la inmovilización covalente de la enzima glucosa oxidasa. Los avances de
este método, tanto en los en materiales de soporte como en los distintos
procedimientos de inmovilización, realizados en los últimos años están siendo
satisfactorios, permitiendo aplicar la glucosa oxidasa en distintos procesos como
envasado activo o producción industrial de ácido glucónico mediante inmovilización
covalente.
Palabras clave: glucosa oxidasa, inmovilización, unión covalente, aplicaciones,
industria alimentaria.
Abstract
The enzymes are biological catalysts that it plays a main role in different biochemical
processes in the food industry. One of the most widely used enzymes in this field is
glucose oxidase due, in part, to its oxidizing properties by converting glucose to
gluconic acid producing hydrogen peroxide. The immobilization of glucose oxidase has
been used as a strategy to improve its activity and stability and also allow its reuse,
thus allowing industrial processes to be more profitable. One of the most prominent
immobilization methods is immobilization by covalent bonding, mainly because the
binding of the enzyme with the support is very stable. In this work, a bibliographic
review of recent advances in the covalent immobilization of the enzyme glucose
oxidase is made. The advances of this method, both in support materials and in the
different procedures carried, out in recent years are being satisfactory, allowing the
application of glucose oxidase in different processes such as active packaging or
industrial production of gluconic acid through covalent immobilization.
Keywords: glucose oxidase, immobilization, covalent bond, applications, food industry.
2. Introducción
En los últimos años se ha observado un gran aumento en el uso de enzimas en
diversas industrias, como la farmacéutica, la biotecnológica, la química y, sobre todo,
en la industria alimentaria. La importancia de las enzimas en la industria alimentaria
proviene de las ganancias que se obtienen de su uso, mejorando los procesos de
fabricación y la calidad de los alimentos, por lo que su venta se ha incrementado de
manera constante en los últimos años (del Moral y col., 2015).
Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica que tienen la capacidad de acelerar
y facilitar reacciones químicas (Sánchez-Ramírez y col., 2014). Las enzimas, también
llamadas catalizadores biológicos, controlan la mayoría de los procesos bioquímicos
en los organismos y, normalmente, la concentración de enzima necesaria es muy
pequeña (Enderle y col., 2012). Algunas cuestiones que han limitado la utilización de
enzimas en diversos procesos son las condiciones de trabajo bajo las cuales las
enzimas son estables y el gran coste del proceso por el alto precio de las enzimas.
Gracias a los procesos de inmovilización de enzimas, los problemas mencionados
anteriormente se pueden solucionar en gran medida, ya que, por ejemplo, la
inmovilización permite la reutilización de la enzima, entre otras ventajas (Cabral y col.,
2018). Uno de los procesos de inmovilización de enzimas que existe actualmente es la
inmovilización por unión covalente, un método que en los últimos años está recibiendo
bastante atención por parte de los investigadores por sus múltiples ventajas, entre las
cuales destacan su sencillez, la gran estabilidad de la enzima inmovilizada y que no
hay pérdida de la enzima después del proceso de inmovilización.
Por otro lado, la enzima glucosa oxidasa está recibiendo también bastante atención
debido a sus diversas aplicaciones en las distintas industrias, entre ellas la industria
alimentaria. La reacción catalizada por la glucosa oxidasa transforma la glucosa en
ácido glucónico eliminando oxígeno y generando peróxido de hidrógeno, una
propiedad interesante en el campo de la conservación de alimentos, ya que la enzima
tiene efecto oxidante y el peróxido de hidrógeno actúa como un agente antibacteriano
y antifúngico (Wong y col., 2008).
Las aplicaciones de la glucosa oxidasa se encuentran en la industria de la
panificación, mejorando las propiedades sensoriales de los productos (Kouassi-Koffi y
col., 2018), actuando como conservante o antioxidante por su capacidad de eliminar
oxígeno, utilizándose también en la industria láctea como agente antibacteriano (Wong
y col., 2008), en la producción de vino con bajo contenido en alcohol porque en su
reacción se elimina la glucosa que de otro modo se convertiría en alcohol (Valencia y
col., 2017) y en la producción de huevo en polvo para evitar el pardeamiento no
enzimático o reacción de Maillard (Zia y col., 2013).
3. Justificación
Como se ha comentado anteriormente, la utilización de la enzima glucosa oxidasa en
el campo de la industria alimentaria se encuentra en pleno auge desde hace unos
años debido a sus múltiples propiedades, beneficios y aplicaciones. Los procesos de
inmovilización de enzimas, entre los cuales se encuentra la inmovilización por unión
covalente, permiten una mejora en la actividad y estabilidad de la enzima y, también,
reducir los costes al permitirse su reutilización.
Por lo tanto, es necesario conocer los últimos avances en la inmovilización por unión
covalente de la enzima glucosa oxidasa para poder seguir optimizando este proceso
de inmovilización y permitir la utilización de esta enzima inmovilizada de manera
óptima y eficaz en diversos ámbitos de la industria alimentaria.
4. Objetivos
El principal objetivo de esta revisión consiste en estudiar la inmovilización por unión
covalente de la enzima glucosa oxidasa recopilando toda la información actual
existente sobre este método. Para hacer este estudio, en primer lugar, se revisará
información sobre la enzima glucosa oxidasa y los distintos métodos de inmovilización
enzimáticos que existen, revisando posteriormente los últimos avances en la
inmovilización por unión covalente de la enzima glucosa oxidasa. Por otro lado,
también se estudiarán las aplicaciones de esta enzima inmovilizada covalentemente
en la industria alimentaria.
5. Material y métodos
En este estudio se ha realizado una búsqueda masiva de documentos y artículos
científicos en relación con los avances sobre la enzima glucosa oxidasa, sus distintos
mecanismos de inmovilización, centrándonos en la inmovilización covalente y sus
posibles aplicaciones en la industria, destacando la industria alimentaria. Para la
recopilación de datos se utilizaron las siguientes bases de datos: Web of Science
(WOS), Scopus, ScienceDirect y, por último, Google Scholar, considerando que estas
bases de datos cubren los campos necesarios para realizar dicha revisión. La
búsqueda se basó en las siguientes palabras claves: glucosa oxidasa, inmovilización,
unión covalente, aplicaciones, industria alimentaria.
También se encontraron documentos a partir de las referencias de otros artículos y/o
revisiones bibliográficas. Los criterios de inclusión que se tuvieron en cuenta fueron
que los artículos estuvieran en inglés o bien en español. En cuanto al rango de fecha
de la publicación, para la búsqueda de la información general sobre la glucosa oxidasa
y sus distintas aplicaciones en la industria alimentaria, así como los distintos tipos de
inmovilización de enzimas que existen no se ha hecho ninguna restricción temporal.
Por otro lado, para la búsqueda de los avances en la inmovilización covalente de la
enzima glucosa oxidasa y sus aplicaciones inmovilizada covalentemente en la
industria alimentaria nos hemos centrado en los últimos 10 años. Se ha excluido
aquellos trabajos encaminados al desarrollo de biosensores y células de biofuel con la
enzima glucosa oxidasa inmovilizada covalentemente que por la amplia información
que se ha encontrado pueden ser objeto de revisiones específicas. En cuanto al
proceso de selección de los artículos, se revisaron todos los resúmenes y
conclusiones, y, en algunos casos, los artículos completos con el fin de poder decidir si
la información que había en ellos estaba relacionada con el objetivo de nuestro
trabajo. Finalmente, si el tema tratado en el documento era de interés, el documento
ha sido transcrito para adecuarlo a la redacción del presente documento.
6. Resultados y discusión
En este apartado de la revisión se describe toda la información que se ha encontrado
una vez procesada y ordenada. En primer lugar, se describen las características
generales de la enzima glucosa oxidasa. En segundo lugar, se describen las distintas
aplicaciones de la glucosa oxidasa en la industria alimentaria. En tercer lugar, se
realiza una revisión de los distintos sistemas de inmovilización de enzimas que
existen, destacando sus ventajas y desventajas. Por último, se describen los últimos
avances en soportes y procedimientos que existen en los procesos de inmovilización
por unión covalente de la enzima glucosa oxidasa, así como las distintas aplicaciones
en la industria alimentaria de esta enzima inmovilizada covalentemente.
6.1. Aspectos generales de la enzima glucosa oxidasa
La glucosa oxidasa fue descubierta a finales de la década de 1920 en extractos del
hongo Aspergillus niger. Esta enzima presenta un grupo prostético: FAD (flavín-
adenina-dinucleótido) y posee dos dominios, por lo que es una enzima oligomérica
(Valenzuela y col., 2007). La glucosa oxidasa pertenece a la familia de las
oxidorreductasas (β-D-glucosa: oxígeno-1-oxidorreductasa; EC 1.1.2.3.4) la cual
cataliza la reacción de oxidación de la β-D-glucosa a ácido glucónico, utilizando
oxígeno molecular como un aceptor de electrones con producción simultánea de agua
oxigenada (Figura 1). Se ha observado que la glucosa oxidasa es altamente específica
con el anómero β de D-glucosa, no ocurriendo lo mismo con el anómero α el cual no
parece ser un sustrato adecuado (Bankar y col., 2009). La glucosa oxidasa es un
enzima que tiene efecto oxidante debido a la liberación de peróxido de hidrógeno en
su reacción catalítica.
Figura 1. Representación esquemática de la reacción catalizada por la glucosa
oxidasa (Bankar y col., 2009).
Esta enzima es soluble en agua y prácticamente insoluble en etanol, cloroformo y éter.
El pH óptimo para su activación es de 5,5, pudiendo presentar actividad entre pH de
4,0 a 7,0 y su temperatura óptima oscila entre 30ºC y 40ºC (Singh y col., 2013).
La glucosa oxidasa puede obtenerse de una gran variedad de fuentes distintas,
incluyendo plantas, animales, hongos, insectos, bacterias, algas rojas y frutas cítricas
(Dubey y col., 2017). La función principal de la glucosa oxidasa es de defensa contra
bacterias y hongos patógenos en los organismos en los que se encuentra gracias a la
propiedad de mantener una producción permanente de peróxido de hidrógeno, lo que
permite un estrés oxidativo y, por lo tanto, que no exista crecimiento de patógenos
(Wong y col., 2008).
La glucosa oxidasa es una enzima ampliamente utilizada y muy importante, ya que,
por ejemplo, es necesaria para evaluar los niveles de glucosa en sangre, una tarea
analítica que formó parte del 40% del total de todas las pruebas de sangre realizadas
en un año (Steiner y col., 2011). Por otro lado, la glucosa oxidasa se selecciona con
frecuencia como enzima modelo para investigar nuevos métodos de inmovilización
(Nery y col., 2016).
6.2. Aplicaciones de la enzima glucosa oxidasa en la industria
alimentaria
Hoy en día, la glucosa oxidasa se considera una enzima segura y está disponible
comercialmente para su uso como aditivo en la industria alimentaria en formato líquido
o en polvo gracias a sus propiedades antioxidantes, estabilizantes y conservantes
(Wong y col., 2008). A continuación, se detallan las distintas aplicaciones que puede
tener la enzima glucosa oxidasa en la industria alimentaria:
- Elaboración de pan
La aplicación de enzimas como aditivo en la industria de panificación es una opción
muy interesante para mejorar el rendimiento de la masa de trigo dado que se
consideran coadyuvantes alimenticios naturales no tóxicos. La glucosa oxidasa es la
alternativa enzimática más adecuada frente a los agentes oxidantes químicos para
mejorar la masa de pan (Wang y col., 2011). Se ha observado que al añadir
determinadas concentraciones de glucosa oxidasa en la masa de trigo se obtiene una
mejora en la calidad del pan y un fortalecimiento en la masa de trigo. La cantidad de
enzima añadida debe ser la adecuada porque se observaron efectos adversos al
agregar niveles más altos de enzima (Bonet y col., 2006). Otras investigaciones
también han observado un efecto positivo por la adición de glucosa oxidasa en masas
de harina de trigo, observando masas con un mayor volumen y mejoras en el grano de
la miga (Vemulapalli y col., 1998). El mecanismo por el cual la glucosa oxidasa
produce estas mejoras es que el peróxido de hidrógeno producido en la reacción
provoca la oxidación de las unidades de sulfhidrilo libres de la proteína del gluten, lo
que da enlaces disulfuro y la gelificación de los pentosanos, provocando un cambio en
las propiedades reológicas de la masa.
- Antioxidante / conservante
Como se ha mencionado anteriormente, la reacción general catalizada por la glucosa
oxidasa implica el consumo de glucosa y oxígeno para producir ácido glucónico y agua
oxigenada. Esta reacción consume oxígeno, lo cual es una propiedad interesante ya
que la presencia de oxígeno es un problema en muchos productos alimenticios como
productos con alto contenido en grasa (mayonesa, por ejemplo), donde la oxidación de
los lípidos puede ocasionar un sabor rancio. De la misma forma, en bebidas como el
vino o la cerveza, la ausencia de oxígeno evita reacciones de oxidación. En alimentos
enlatados, embotellados o envasados, el oxígeno promueve el crecimiento microbiano,
por lo que es adecuado promover un ambiente anaeróbico. (Wong y col., 2008).
Por otro lado, el ácido glucónico producido en la reacción enzimática se considera
seguro para el consumo humano y la OMS no ha establecido un límite en su ingesta
diaria aceptable. A esto se le suma una mayor demanda por parte de los
consumidores de productos que no contengan antioxidantes químicos, por lo que la
enzima glucosa oxidasa presenta un gran potencial en el campo de la conservación de
alimentos.
La enzima glucosa oxidasa también puede servir como conservante utilizándola sobre
los materiales de envase de productos lácteos y de panificación para prevenir el
crecimiento de levaduras y bacterias aeróbicas eliminando el oxígeno (Suppakul y col.,
2003).
- Producción de huevo en polvo
Un efecto indeseado en ciertos productos alimentarios es el pardeamiento no
enzimático o reacción de Maillard. Se produce por la reacción del grupo amino de la
proteína con los azúcares reductores, dando como resultado un sabor no deseado y
un pardeamiento indeseable en el huevo en polvo deshidratado. Para evitar este
pardeamiento, la glucosa oxidasa se utiliza de manera eficaz para eliminar la glucosa y
el oxígeno residuales de los alimentos y de esta manera, prolongar su vida útil (Zia y
col., 2013). Este pardeamiento también está presente en productos como la patata,
por lo que la aplicación de la glucosa oxidasa puede proporcionar buenos resultados
para reducir el pardeamiento no deseado de la misma manera (Low y col., 1989).
- Producción de vino con bajo contenido alcohólico
Actualmente existe una creciente demanda por parte de los consumidores de vinos
que contengan niveles más bajos de alcohol y también de conservantes químicos. La
glucosa oxidasa juega un papel importante en la producción de este tipo de vinos
porque se utiliza para reducir el contenido alcohólico al eliminar parte de la glucosa del
mosto que, de otro modo, se convertiría en etanol a través de procesos fermentativos
anaeróbicos (Dubey y col., 2017). Por otra parte, en las regiones climáticas más
cálidas, los niveles de azúcar en la uva son más altos que en regiones climáticas más
frías, y, por lo tanto, los vinos poseen niveles de alcohol más altos (Malherbe y col.,
2003). Este punto podría ser interesante por el hecho de que nuestro planeta está
sufriendo un cambio climático que provocará un aumento de las temperaturas y, por lo
tanto, los vinos tendrán un grado alcohólico superior. Se ha demostrado que la
utilización de la glucosa oxidasa puede reducir hasta el 87% de la glucosa libre de la
uva en ácido glucónico (Bankar y col., 2009).
- En la industria láctea
Como se ha mencionado anteriormente, una de las aplicaciones más importantes de la
glucosa oxidasa se encuentra en la conservación de alimentos. El sistema
lactoperoxidasa es un agente bacteriostático que se encuentra en algunas secreciones
como la leche o la saliva de mamíferos. Este sistema consta de tres componentes: la
enzima lactoperoxidasa, el tiocianato (SCN
-
) y el peróxido de hidrógeno. La catálisis
por la lactoperoxidasa genera intermedios activos que son seguros y poseen
propiedades antimicrobianas. Este sistema cuando se utiliza junto con la glucosa
oxidasa es un agente antimicrobiano muy útil ya que la presencia de esta enzima y su
sustrato, que es la glucosa, permiten que el peróxido de hidrógeno que requiere el
sistema lactoperoxidasa se genere y reponga continuamente (Wong y col., 2008).
Dicho sistema es efectivo en la leche cruda previniendo su deterioro en el transporte y
almacenamiento y aumentando la vida útil del producto. Este sistema también se
puede utilizar en la producción de queso porque el ácido glucónico producido se utiliza
para la acidificación directa del queso.
6.3. Visión general de los sistemas de inmovilización de enzimas
La inmovilización de enzimas, a pesar de ser un proceso que se conoce desde hace
más de 100 años, sigue siendo una herramienta biotecnológica en continuo estudio
para mejorar las propiedades catalíticas de las enzimas. Las enzimas inmovilizadas
son definidas como enzimas físicamente localizadas o confinadas en una región
definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad
catalítica y que pueden ser reutilizadas de forma repetida (Arroyo, 1998). La
inmovilización combina la actividad elevada y específica de las enzimas con la
estabilidad química y mecánica del soporte. Esto consiste en mantener la enzima
unida o atrapada en un soporte físico, conservando su actividad catalítica y
permitiendo el flujo de sustratos y productos (Fajardo-Ochoa y col., 2011).
Las técnicas de inmovilización que se emplean deben cumplir algunas características
fundamentales que son las siguientes (Papamichael y col., 2020):
- Simplicidad.
- Bajo coste de la matriz de inmovilización y del proceso.
- Estabilidad, durabilidad, reutilización y fácil recuperación de la enzima
inmovilizada.
- Mantenimiento de la actividad selectiva de la enzima.
En muchas ocasiones, las aplicaciones de las enzimas inmovilizadas son más eficaces
que sus formas libres, dado que evitan el coste de añadir nuevas enzimas y no
reutilizarlas y la existencia de problemas de estabilidad por efectos del pH y la
temperatura (Cao, 2005).
Por lo tanto, las ventajas más significativas de los procesos de inmovilización de las
enzimas son las siguientes (Dwevedi, 2016):
- Manejo más sencillo de la enzima.
- Capacidad de reutilizar la enzima (útil especialmente para enzimas costosas).
- Mayor estabilidad en condiciones físicas y químicas extremas.
- El proceso completo es más viable desde el punto de vista económico.
- Las enzimas inmovilizadas se adaptan a todo tipo de procesos industriales.
Del modo contrario, los principales inconvenientes que se pueden presentar con la
inmovilización enzimática son los siguientes (Sánchez-Ramírez y col., 2014):
- Alteración de la conformación de la enzima.
- Pérdida total o parcial de la actividad enzimática.
- Presencia de fracciones de enzimas inmovilizadas con diferente número de
uniones al soporte, lo que modifica su actividad enzimática y estabilidad.
- Los procesos de inmovilización son costosos.
Hoy en día existen distintos métodos para la inmovilización enzimática. Es importante
que se escoja el método de inmovilización más adecuado para cada enzima, para
asegurarnos que después de la inmovilización, la efectividad de la enzima sigue
persistiendo (Fajardo-Ochoa y col., 2011). A continuación, se detallan los distintos
métodos de inmovilización de enzimas que existen, mostrándose en la Figura 2 un
esquema de los mismos.
Figura 2. Representación esquemática de los distintos métodos de inmovilización de
enzimas, donde E representa una molécula de enzima libre. Adaptado de Sirisha y col.
(2016).
Inmovilización por unión covalente
La inmovilización enzimática por unión covalente es uno de los métodos donde se
encuentran los desarrollos recientes más interesantes (Papamichael y col., 2020) y
que más se utiliza actualmente (Nguyen y col., 2017).
Este método consiste en la formación de complejos estables enzima-matriz de
inmovilización a través de enlaces covalentes. Generalmente, el procedimiento de
unión de la enzima al soporte sólido tiene dos etapas: una primera etapa de activación
de la superficie para proporcionar grupos reactivos con los aminoácidos de la enzima,
y una segunda etapa de acoplamiento covalente de la enzima al soporte activado.
Para reducir los problemas de accesibilidad del sustrato al centro activo de la enzima
inmovilizada se pueden emplear moléculas que se comportan como brazos
alargadores entre la superficie y la enzima (Nguyen y col., 2017). Si los aminoácidos
del centro activo de la enzima participan en la unión covalente con el soporte se puede
producir una desactivación total o parcial de la enzima. Para evitar este problema, el
proceso de inmovilización se puede llevar a cabo en presencia de un sustrato o un
inhibidor de la enzima. De esta forma se ocupa el centro activo de la enzima durante la
inmovilización por estas moléculas (Sulaiman y col., 2014).
Las enzimas contienen hasta 20 aminoácidos diferentes, pero no todos se encuentran
expuestos al exterior de las proteínas. Los principales grupos expuestos son la lisina, a
través de su grupo ε-amino, la tirosina e histidina, los grupos cisteína y, en menor
medida, también la metionina, triptófano, arginina, ácido aspártico y ácido glutámico
(Sheldon y col., 2013). Estos aminoácidos son los que mayoritariamente participarán
en el proceso de inmovilización covalente con el soporte.
Este método ampliamente utilizado en la industria alimentaria presenta las siguientes
ventajas (Fajardo-Ochoa y col., 2011):
- La manipulación de las enzimas es sencilla.
- La carga de la enzima permanece constante después de la inmovilización.
- Los enlaces formados entre las enzimas y el soporte son muy estables.
- No existe liberación de enzimas en la solución.
- La enzima posee una mayor estabilidad frente a la desactivación por el efecto
de la temperatura, de disolventes orgánicos o efectos de pH.
En cambio, este tipo de inmovilización también presenta ciertos inconvenientes que es
necesario conocer (Elnashar, 2010; Sánchez-Ramírez y col., 2014):
- Puede existir pérdida de la actividad enzimática.
- Los buenos soportes suelen ser bastantes caros, por lo que el proceso puede
tener un alto coste.
- Se requiere la protección del centro activo para evitar una posible alteración.
Inmovilización por adsorción
La adsorción enzimática es uno de los métodos más sencillos para inmovilizar. Los
mecanismos de adsorción se basan en enlaces débiles, como las fuerzas de Van der
Waal, interacciones electrostáticas e hidrofóbicas (Sassolas y col., 2012), y en función
del tipo de enlace la inmovilización por adsorción se puede clasificar en tres
categorías: adsorción física, enlace electrostático y adsorción hidrofóbica (Nguyen y
col., 2017).
La enzima se disuelve en una solución y el soporte sólido se pone en contacto con la
solución de enzima durante un tiempo determinado en unas condiciones adecuadas
que permitan la inmovilización de la enzima. Las moléculas de enzima que no se
absorben se eliminan de la superficie lavando con una solución tampón (Nguyen y col.,
2017). Es un sistema de inmovilización que permite que las moléculas de enzima
adsorbidas se encuentren protegidas de la agregación, proteólisis e interacciones
hidrofóbicas (Spahn y col., 2008).
Los investigadores han utilizado soportes ecológicos como las fibras de coco, las
cuales tienen buena capacidad de retención de agua y alta propiedad de intercambio
catiónico; celulosa microcristalina con capacidad de unión reversible; caolín con alta
capacidad de retención de enzimas; y materiales micro/mesoporosos, ofreciendo una
gran área de superficie ideal para las reacciones enzimáticas (Datta y col., 2013).
La inmovilización por adsorción presenta múltiples ventajas ya que nos encontramos
ante un proceso simple y económico dado que no es un proceso que necesite de
reactivos. Por otra parte, este tipo de inmovilización no es destructivo para la actividad
enzimática porque no implica ninguna funcionalización del soporte (Nguyen y col.,
2017). De modo contrario, la inmovilización por adsorción también presenta
inconvenientes ya que las enzimas se unen de forma débil al soporte mediante una
unión física débil, de modo que los cambios de temperatura, pH o fuerza iónica
pueden provocar procesos de desorción/lixiviación de la enzima (Mohamad y col.,
2015). Otro inconveniente es que sólo se puede controlar la reacción en periodos
cortos de tiempo (Romero y col., 2014).
Inmovilización por reticulado o entrecruzamiento
Esta técnica ha sido ampliamente utilizada en la estabilización de diversas enzimas,
las cuales se pueden unir entre ellas, sin soporte, a través del entrecruzamiento. Este
método de inmovilización sin soporte consiste en el uso de reactivos bifuncionales que
originan uniones intermoleculares entre las moléculas de la enzima. Como reactivos
bifuncionales se utilizan dialdehídos, diiminoésteres, diisocianatos, sales de
bisdiazonio y aminas activadas con carbodiimida (Arroyo, 1998), aunque el reactivo
más ampliamente utilizado es el glutaraldehído (Nguyen y col., 2017).
Los procedimientos de inmovilización por reticulado se pueden distinguir en dos tipos:
mediante agregados enzimáticos reticulados (CLEA) o por medio de cristales de
enzimas reticulados (CLEC). En el caso del procedimiento utilizando CLEA, las
enzimas inmovilizadas también funcionan en soluciones acuosas y son estables en
condiciones con concentraciones elevadas de sales metálicas, solventes orgánicos
polares y apolares. Las enzimas inmovilizadas en el caso de la utilización de CLEC,
generalmente poseen mejoras significativas en las propiedades mecánicas, dando
como resultado una mayor estabilidad y eficiencia que las enzimas no tratadas
(Nguyen y col., 2017; Papamichael y col., 2020).
La inmovilización por entrecruzamiento es un método muy simple basado en la fuerte
unión química de biomoléculas enzimáticas, por lo que la posible fuga de enzimas es
mínima. Otra ventaja destacada es la posibilidad de utilizar agentes estabilizantes
adecuados para ajustar el microambiente de la enzima y, de este modo, aumentar la
estabilidad (Nguyen y col., 2017). Este método también posee inconvenientes, siendo
susceptible a cambios leves de temperatura y pH en las condiciones de operación
(Fajardo-Ochoa y col., 2011). Otro inconveniente es que el uso de glutaraldehído
podría dar como resultado graves modificaciones enzimáticas conduciendo a cambios
conformacionales enzimáticos y, por consiguiente, pérdida de su actividad. Para
solventar este problema, se pueden agregar proteínas inertes como gelatina o
albúmina de suero bobino durante la inmovilización para minimizar la modificación de
las enzimas (Nguyen y col., 2017).
Inmovilización por atrapamiento
Este método de inmovilización implica la retención física de la enzima en las cavidades
interiores de una matriz sólida porosa formada generalmente por prepolímeros
fotoentrecruzables o polímeros del tipo alginato, acrilamida, colágeno, etc. (Arroyo,
1998). Este sistema permite el intercambio del sustrato y los productos, pero retiene la
enzima, por lo que la difusión de la enzima está limitada (Çil y col., 2007). Sin
embargo, solo se puede utilizar en un número limitado de enzimas (Dwevedi, 2016),
siendo un método poco eficaz para enzimas que emplean sustratos de elevado peso
molecular, ya que los microporos del soporte dificultan la entrada del sustrato al centro
activo de la enzima.
El procedimiento de inmovilización por atrapamiento consiste en dos pasos (Nguyen y
col., 2017): una primera etapa en la que se produce la mezcla de enzima en una
solución de monómero, y una segunda etapa en la cual se produce la polimerización
de la solución del monómero elegido mediante una reacción química o condiciones
experimentales cambiantes. Uno de los polímeros más empleado es el alginato de
calcio, con el cuál se consigue un atrapamiento eficiente y se evita la pérdida de la
enzima (Romero y col., 2014).
La ventaja más destacable de este método es su eficiencia a la hora de inmovilizar la
enzima. Por otra parte, podemos también destacar que la enzima no sufre ningún tipo
de alteración estructural ya que el método de unión es físico y no químico (Matosevic y
col., 2011). Otra ventaja adicional es la capacidad de optimizar las condiciones de la
inmovilización, gestionando el microambiente de la enzima inmovilizada y teniendo
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