10 07/09
∙INTRODUCCIÓN A LA GENÉTICA MOLECULAR -Genómica, Transcriptómica y Proteómica: concepto. Genoma, transcriptoma y
proteoma humanos. Su variedad intra e interindividual, normal y patológica (Clase teórica). -Ácidos nucleicos y
proteínas: componentes químicos. Estructura del ADN según el modelo de Watson y Crick. Estructura del ARN. Tipos de ARN.
Diferencias entre el ADN y el ARN. Aminoácidos presentes en las proteínas humanas. Estructura primaria, secundaria, terciaria y
cuaternaria de las proteínas. -Organización funcional del material genético: Organización y cambios funcionales de la
cromatina. Secuencias de ADN no repetidas y poco repetidas. ADN repetitivo. Concepto molecular de gen. Estructura básica de
un gen: promotor, secuencias reguladoras (amplificadores e inhibidores), segmento codificador (exones e intrones), secuencia
de terminación. -Flujo de la información genética y control de la expresión génica: El “dogma” fundamental de la Biología
Molecular actualizado. Etapas en las que se puede controlar la expresión génica en eucariotas (Alberts, cap 9).
∙ÁCIDOS NUCLEICOS Y PROTEÍNAS Concepto e importancia médica de los procesos que experimentan.
-ADN: Replicación del ADN. Síntesis del ADN telomérico. Cambios en la torsión de la doble hélice. Recombinación.
Reordenamiento genómico. Mutación. Reparación. Metilación. Transcripción. -ARN: Procesamiento. Pasaje del núcleo al
citoplasma. Traducción. Interferencia mediada por ARN. -Proteínas: Procesamiento. Compartimentalización. Modificación del
estado funcional.
∙TÉCNICAS BÁSICAS EN GENÉTICA MOLECULAR: DESCRIPCIÓN BREVE, APLICACIÓN E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
-Aislamiento de ácidos nucleicos y proteínas. Digestión enzimática (concepto y utilidad de las enzimas de restricción) y otros
métodos de fraccionamiento. Separación electroforética. Hibridación: Concepto. Southern, Northern y Western blots. Sondas de
ADN genómico, ADN complementario y de ARN: concepto y utilización. Secuenciamiento del ADN. Reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). Micromatrices. Edición genómica.
•SE ENCARGA DEL ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA Y LA FUNCIÓN DE LOS GENES A NIVEL MOLECULAR.
•Es la rama de la genética que comprende el estudio del genoma
completo de un organismo, a diferencia de la genética que estudia un
gen en concreto.
•La genómica ESTRUCTURAL y FUNCIONAL, ambas sub disciplinas de
la genómica, a su vez se subdividen en:
-GENÓMICA o estudio del genoma
-PROTEÓMICA o estudio del proteoma
-TRANSCRIPTÓMICA o estudio del transcriptoma, las tres se encargan
de caracterizar estructuras y funciones, establecer interrelaciones,
describir procesos y desarrollar tecnologías.
•GENOMA: dotación completa del material genético de un
organismo, consiste en 46 cromosomas y ADN mitocondrial, almacena
toda la información biológica de un organismo
•PROTEOMA: conjunto de proteínas elaboradas por un organismo.
•TRANSCRIPTOMA: conjunto de moléculas de ARN mensj (mARN) y de ARN no- codificante presente en una celula.
( )
•El NUCLEOTIDO es su unidad estructural, está constituido por
una base nitrogenada + pentosa + fosfato
-PENTOSA
Los carbonos se enumeran del 1´, al cual está unida
covalentemente la BN, a 5´, que se une al fosfato mediante
esterificación.
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La presencia o ausencia del OH en 2´es lo que diferencia a la ribosa (ARN) de la desoxiribosa (ADN).
Y la ausencia de los OH en 2´y 3´es lo que caracteriza a los didesoxirribonucleotidos que se utilizan en la
secuenciacion de Sanger.
-BASES NITROGENADAS
Pueden derivar de la purina (bases púricas = 2 ciclos) o de la pirimidina (bases pirimídicas= 1 ciclo).
Bases púricas: ADENINA y GUANINA
Bases pirimidicas: CITOSINA, TIMINA y URACILO
•NUCLEOTIDO
•POLINUCLEOTIDO
Varios nucleótidos unidos entre sí forman los ácidos nucleicos, que son por lo
tanto polinucleotidos.
En un polinucleótido lineal las unidades se vinculan entre sí por uniones
fosfodiester, cada unidad está unida a la anterior mediante su fosfato en 5´ y al
fosfato de la siguiente, mediante su OH en 3´.
Quedan libres solo el fosfato en 5´del 1° nucleótido y el OH en 3° del último y
ellos definen el sentido de la nomenclatura y la síntesis de los poli nucleótidos y
también de la operación de múltiples enzimas
( )
•ESTRUCTURA DEL ADN (MODELO DE WATSON Y CRICK – ADN tipo B)
-Helicoide
-Dextrógiro (tipo A, B) correspondiente a condiciones de humedad
reducida o levógiro (Z) correspondiente a secuencias muy ricas en
citosina y guanina.
-2 cadenas de polinucleótidos (BN –
DR –P)
-Las 2 cadenas son complementarias. Por lo tanto, la cantidad de
bases pirimidicas y púricas son iguales y están vinculadas por
puentes hidrogeno (A=
T y G≡C)
-Las 2 cadenas son antiparalelas, el extremo 5´está enfrentando al
extremo 3´de la otra cadena.
-La longitud de una molécula puede medirse en pares de
nucleótidos o en pares de bases (PB).
-El ADN tiene carga negativa
Las bases nitrogenadas del ADN son: ADENINA – GUANINA - TIMINA – CITOSINA
Las bases nitrogenadas del ARN son: ADENINA – GUANINA - URACILO – CITOSINA
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( )
•ESTRUCTURA
-1 cadena de polinucleótidos (BN –
R –P)
-La longitud de una molécula puede medirse en nucleótidos o bases.
-Las BN generas autocomplementariedad mediante puentes hidrogeno (A=U y G≡C, bases
canónicas).
-Dan lugar a diversas estructuras secundarias, según la particular secuencia de nucleótidos y la
existencia de bases canonicas, bases no apareadas y de uniones débiles entre ellas genera
estructuras terciarias.
•TIPOS
-ARN mensajero (ARNm): copia la información contenida en el ADN
(núcleo) y sale al citosol, donde sirve de molde para la síntesis de la
proteína. / Recoge la información de los genes y dirige la síntesis de
proteínas.
-ARN ribosómico (ARNr): existen varios tipos, son
fundamentalmente estructurales, forman parte de los ribosomas.
-ARN de transferencia (ARNt): existen varios tipos, transporta
aminoácidos libres hacia el ribosoma siguiendo el orden que
marca la información genética del ARNm.
ADN
ARN
PENTOSA
DESOXIRRIBOSA
RIBOSA
BASES
G, A, C, T
G, A, C, U
NUCLEÓTIDOS
DESOXIRRIBONUCLEÓTIDOS
RIBONUCLEÓTIDOS
N° DE CADENAS
2 (BICATENARIO y ANTIPARALELO)
1 (UNICATENARIO)
UBICACIÓN
NUCLEO, MITOCONDRIAS, CLOROPLASTOS.
VIRUS
CITOPLASMA, NÚCLEO, MITOCONDRIAS,
CLOROPLASTOS. VIRUS
FUNCIÓN
ALAMACENA LA INFORMACIÓN GENÉTICA
REGULA LA EXPRESIÓN GENÉTICA
ESTRUCTURA
-DOBLE α-HÉLICE
TIPOS:
-ARNm: codones
-ARNt: anticodones
-ARNr
Son macropéptidos. Las proteínas contienen un número
superior a 100 aminoácidos.
•ESTRUCTURA
-Están constituidas por los 20 aminoácidos cuya
incorporación secuencial es lo que el ADN y ARNm codifican
para formar 1 cadena polipeptidica cuyas unidades se
vinculan entre sí mediante uniones peptídicas
-Existen 4 niveles de organización estructural:
ESTRUCTURA PRIMARIA: comprende la secuencia de los
aminoácidos que forman la cadena proteica. Tal secuencia
determina los demás niveles de organización de la molécula.
ESTRUCTURA SECUNDARIA: alude a la estructura espacial de la proteína, que deriva de la posición de
determinados aa en su cadena.
-Las asociaciones de las proteínas se estabilizan mediante enlaces diversos.
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Los puentes disulfuro, los puentes hidrogeno, grupos polares y los grupos no polares contribuyen al plegamiento de
un polipeptido para formar los dos “motivos” de la estructura secundaria: la alfa hélice (α) y hoja plegada (β).
Entre motivo y motivo se encuentran segmentos polipeptidicos no tan estructurados, cuya plasticidad es
fundamental para disposición tridimensional propia de la estructura terciaria.
ESTRUCTURA TERCIARIA: Comprende la estructura tridimensional del polipéptido, es consecuencia de de nuevos
plegamientos en las estructuras secundarias alfa hélice (α) y hoja plegada (β).
Los nuevos plegamientos se producen por interacciones entre los aa. Según el plegamiento que adopten pueden
generar proteínas fibrosas o globulares.
ESTRUCTURA CUATERNARIA: resulta de la combinación de 2 o más polipéptidos.
-Las proteínas interactúan mediante afinidad mutua 3D
•NOTACIÓN DE LOS AMINOACIDOS
-Los 20 aa están listados junto a como se los representa, utilizando
códigos de 3 letras o una sola.
-
AA E: no los podemos sintetizar y debemos obtenerlos con la
dieta.
-AA No E: podemos sintetizarlos.
Organización funcional del material genético
•CROMATINA: complejo de ADN, proteínas histonas y no histonas. Es el material con el que están compuestos los
cromosomas.
Los cambios en la estructura de la cromatina se producen cuando el ADN se duplica y durante la expresión génica.
•LOS CROMOSOMAS POSEEN SECUENCIAS DE ADN NO REPETIDAS, POCO REPETIDAS Y ADN REPETITIVO
La capacidad funcional del ADN, es decir, que pueda generar moléculas de ARN, se basa en la secuencia de sus
nucleótidos.
En algunos sectores el ADN presenta secuencias de nucleótidos que se transcriben y otras que parecen prescindibles.
GENOMA
+50%
SECUENCIAS DE ADN NO REPETIDAS
(UNICAS) O POCO REPETITIVAS
Donde se localizan la mayoría de los GENES
-50%
SECUENCIAS DE ADN REPETITIVAS
REPETICIONES EN
TANDAS
EL INICIO DE UNA REPETICIÓN SE HALLA
INMETIATAMENTE ATRÁS DE OTRA
REPETICIONES
DISPERSAS
COPIAS DISPERSAS EN DISTINTOS PUNTOS
DEL CROMOSOMA
SECUENCIAS DE ADN REPETITIVAS
REPETICIONES EN
TÁMDEM
(no codificantes)
ADN SATÉLITES
5 a 171
PB rept
Se localiza en los CENTROMEROS y BRAZO LARGO del
cromosoma Y. Presente en todos los cromosomas.
MICROSATÉLITES
6 a 26
Presente en todos los cromosomas.
MINISATÉLITES
1 a 6
ADN REPETITIVO de los TELOMEROS y ADN HIPERVARIABLE
(diferente en c/individuo- responde a la herencia
mendeliana).
REPETICIONES
DISPERSAS
SINE
El más estudiado corresponde a la familia Alu, sus copias
constituyen el 13% del genoma
LINE
El más común es el L1, sus copias constituyen el 21% del
genoma.
Secuencia repetida larga, contiene 2 genes
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*SINE y LINE por short/long interspread nuclear element - elemento nuclear intercalado corto/largo.*
•GEN: secuencia de ADN que contiene la información requerida para
fabricar una molécula de ARN y, si este corresponde a un ARN
mensajero, a partir de él construir una proteína. / Secuencia de
nucleótidos que se transcriben.
-Unidad funcional del ADN, ubicada en el locus del cromosoma.
-Unidad física básica de la herencia; genera un carácter físico
heredable, los genes se transmiten de los padres a la descendencia y
contienen la información necesaria para precisar sus rasgos.
-Existen aproximadamente 20000 genes distribuidos en los 46 cromosomas humanos; representan alrededor del
10% del ADN nuclear.
-Las mutaciones que acumulan a lo largo del tiempo pueden resultar beneficiosas para la evolución de la especie.
-Un único gen que produce ARNm es capaz de originar varias clases de proteínas.
•ESTRUCTURA BÁSICA DE UN GEN EUCARIONTE:
-PROMOTOR: elemento que inicia la transcripción y señala a partir de que nucleótido debe transcribirse el gen / el
sitio de iniciación de la transcripción y parte del cual queda incluida en el transcripto.
Generalmente se localiza en el extremo 5´del segmento codificador.
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-SECUENCIAS REGULADORAS: determinan cuando debe transcribirse un gen y cuantas veces debe hacerlo,
generalmente se localizan lejos del codificador. Tipos de reguladores:
AMPLIFICADORES: son más numerosos. Si se elimina una secuencia amp., la velocidad de transcripción disminuye.
INHIBIDORES: Si se elimina una secuencia inhibidora, la velocidad de transcripción aumenta.
Cada gen posee una combinación particular de amplificadores e inhibidores, algunas secuencias pueden repetirse
genes diferentes, pero dos genes diferentes nunca poseen la misma combinación de secuencia reguladora.
-SEGMENTO CODIFICADOR
EXONES: segmentos que contienen la información que va a estar presente en el ARN maduro / inf. genética que
codifica a la proteína.
INTRONES: segmentos no funcionales.
-SECUENCIAS DE TERMINACIÓN: tramo de ADN que marca la conclusión de la síntesis. Ubicado cerca del extremo
3´del segmento codificador. NO es igual que el codón de terminación del ARNm.
El gen tiene exones separados por tantos intrones como
exones haya, menos 1 ( I=E-1 ).
En estrecha relación con ellos se encuentra el promotor.
El ADN relacionado con la transcripción incluye además
secuencias de control que no se transcriben, ubicadas a
una distancia variable, en sentido 5´ o corriente arriba o en
sentido 3´o corriente debajo de la región a transcribir y
ADN espaciador interpuesto.
Las secuencias distales de control pueden ser:
Potenciadoras o enhancer capases de unirse a factores
proteicos y a través de ellos incrementar la secuencia de
iniciación de la transcripción.
Silenciadores o silencers, cuya acción disminuye la
frecuencia de tal iniciación
Aisladoras o insulators, ubicadas entre diferentes genes y encargas de evitar que el complejo enzimático
encargado de la transcripción pase de uno a otro.
•GENOMA HUMANO
-Es la totaidad de la información genética depositada en el ADN
-Es la dotación completa del material genético de un organismo, consiste en 46 cromosomas y ADN mitocondrial,
almacena toda la información biológica de un organismo
-Es un conjunto formado por todas las secuencias de ADN de los 24 cromosomas nucleares, o sea, de 22 autosomas,
1 X y 1Y y 1 ADN mitocondrial.
Se trata de un conjunto ideal, ya que ninguna celula humana normal tiene 24c + 1 ADNm, las células somáticas
normales tienen 2 equivalentes genómicos y los gametos 1 solo.
El genoma nuclear tiene 3.200.000 de pares de bases (Mpb), equivale aproximadamente a 1 metro.
Mas de la mitad es ADN repetitivo, en tandas o disperso
Las variables interindividuales normales o polimorfismos, incluyen decenas visibles al microscopio óptico, miles de
delesciones, inserciones e inversiones subcromosomicas y millones de cambios puntuales.
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ADN M
1 ADN circular
16.569 Kpb
Codifica solo 13 de los aprox 1500 peptidos de una mitocondria humana, pertenecientes a los complejos 1, 3 o 4 de
la cadena respiratoria
Codifica 2 ARN ribosomicos y 22 ARNt
-Genes
Tenemos 20.400 genes que codifican proteínas y 24.000 que no
Flujo de la información genética y control de la expresión génica
El “dogma” fundamental de la Biología Molecular actualizado
adn
REPLICACIÓN / DUPLICACION DEL ADN
-Es la síntesis de 2 moléculas de ADN idénticas entre si e idénticas a la original, para que ambas sean repartidas en
las 2 células hijas.
-Gracias a ella el ADN se propaga en las células de generación en generación.
-Es bidireccional y semiconservativa; la molécula de ADN recibida por la células hijas contiene una cadena original
(preexistente) y una cadena nueva (recién sintetizada).
-Se produce en la fase S
-La replicación comienza por lugares específicos del ADN, llamados ORÍGENES DE REPLICACIÓN.
-OR contienen tramos de ADN especiales compuestos por cientos de nucleótidos. Todos poseen una secuencia en
común, de 11 nucleótidos aprox, denominada secuencia de replicación autónoma (ARS).
-La HELICASA es una enzima que reconoce el OR, se une a él y abre la doble hélice del ADN, se forma la BURBUJA DE
REPLICACIÓN.
-La separación de la cadena avanza en los 2 extremos, y en cada uno da lugar a un estructura en forma de Y, la
HORQUILLA DE REPLICACIÓN. Desaparecen cuando chocan con otras horquillas de burbujas contiguas.
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-Los ADN moldes están asociados a proteínas SSB (proteínas de unión) que mantiene estiradas las cadenas para
evitar que se apareen (vuelvan a unir) las bases complementarias.
-Al separarse la cadena de ADN se produce una tensión torsional o superenrollamiento por delante de cada
horquilla, para que la acción de la Helicasa no se frene, 2 enzimas, la TOPOISOMERASA I y la GIRASA (topoisomerasa
II) producen un desenrollamiento que estabiliza las cadenas (el de la girasa abarca una extensión mayor).
SINTESIS DE LA CADENA CONTINUA/ ADELANTADA / LÍDER
-La ADN PRIMASA cataliza la formación de un cebador o primer, necesario para comenzar la síntesis del ADN.
-La ADN POLIMERASA DELTA (δ) coloca nucleótidos en dirección 5´a 3´.
La cadena hija continua crece en dirección 5´3´ mediante el agregado de nucleótidos en su extremo 3´a medida
que se desplaza la horquilla. Su molde es la cadena progenitora 3´5´
-La ADN NUCLEASA REPARADORA saca el cebador ARN.
-La ADN POLIMERASA β sintetiza segmento de ADN que remplaza al cebador ARN.
-La ADN LIGASA conecta el segmento de ADN con el resto de la cadena continua.
SINTESIS DE LA CADENA DISCONTINUA/ ATRASADA / REZAGADA
-La ADN PRIMASA cataliza la formación de múltiples cebadores.
-La ADN POLIMERASA α sintetiza los FRAGMENTOS DE OKAZAKI (pequeños tramos de ADN), colocando nucleótidos
junto a l extremo 3´ del cebador del FO.
-La ADN NUCLEASA REPARADORA saca los cebadores de ARN.
ADN polimerasa α
ADN polimerasa δ
ADN polimerasa β
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-La ADN POLIMERASA β sintetiza segmento de ADN que remplaza al cebador ARN.
-La ADN LIGASA conecta el segmento de ADN con los FO.
-El segmento de ADN que se sintetiza a partir de un origen de replicación se llama REPLICÓN.
-La replicación concluye cuando se conectan entre si todos los replicones.
-Las polimerasas, helicasas, ligasas y demás proteínas que intervienen en la síntesis de cada cadena lo hacen
integrando o no un complejo multimolecular que se forma en cada horquilla de replicación denominado replisoma.
-Para extender el extremó 3’ del telómero para compensar su acortamiento que se produce en cada ciclo de
replicación interviene una retro transcriptasa. Esta polimerasa dependiente de ARN sintetiza ADN y se expresa en
células de replicación activa, su grupo prostético es una cadena de ARN que incluye la secuencia
5’ CCA CCC CAA 3’
La cual se usa como molde una y otra vez.
Otros procesos que lleva a cabo el adn
-REDISPOSICIÓN: modificación del grado de condensación del ADN.
-RECOMBINACIÓN: intercambio de segmentos de una o ambas cadenas entre distintas regiones del mismo ADN o
entre dos moléculas de ADN distintos específicos del tipo celular.
-METILACIÓN: transformación de un C en un Metil Carbono. Sus patrones pueden ser específicos de sexo o
específicos del tipo celular y se relaciona principalmente con la activación y desactivación de genes y con el distinto
grado de condensación de la cromatina.
-REPARACIÓN: es la sustitución del ADN mutado por ADN original, muy importante en el ADN mitocondrial.
-MUTACIONES:
● Sinónima → sustitución de una base por otra que codifica para el mismo codón y no afecta a la proteína
● Sin sentido → el cambio codifica para un codón de terminaciones
● De marco de lectura → la incorporación o perdida de un nucleótido, que al traducirse crea otra proteína
● Transición → Si intercambian bases con el mismo número de ciclos
● Transversión → Se intercambian bases con número de ciclo diferentes
Transcripción del adn
El TRANSCRIPTO PRIMARIO (molecula de ARN recién hecha / que surge de la transcripción del ADN) es una copia
exacta de la región transcripta de la cadena codificante de la molécula de ADN, excepto que contiene uracilo en
lugar de timina.
Antes de salir del núcleo, su procesamiento dará lugar a un ARN maduro – ARN funcional, el cual entre otras cosas,
carece de los intrones que el gen y el transcripto primario tienen, ya que estos fueron removidos y los exones
empalmados entre sí, dando lugar a un ARNm con información genética continua, apto para dirigir la síntesis de la
proteína.
-Flujo de la información genética y control de la expresión génica: El “dogma” fundamental de la Biología Molecular
actualizado. Etapas en las que se puede controlar la expresión génica en eucariotas (Alberts, cap 9).
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proteoma humano
•COMPONENTES
Repertorio de proteínas que pueden producir las células humanas. Son aprox de 20400 proteínas y sus isoformas.
Tiene tantas versiones reales como etapas de desarrollo, fases del ciclo celular y estados funcionales que presentan
los múltiples tipos celulares
•PROCESOS QUE LO AFECTAN
Traducción
Síntesis de un péptido monocatenario a partir de un ARNm. Intervienen aminoacil ARNt y ribosomas
La información es traducida mediante un código genético
Procesamiento
-Modificaciones químicas postraduccionales
-Plegamiento
El plegamiento adecuado es crítico para el funcionamiento normal de una proteína y el inadecuado puede causar
enfermedad de varias maneras.
Las enfermedades prionicas humanas
son entidades que pueden transmitirse
por herencia y por contagio de animal
a humano y entre humanos.
La imagen representa el cambio de
conformación que una mutación en
PrP heredable de forma autosómica
dominante, causa en la proteína
codificada y como esta proteína anormal puede inducir el mismo cambio de conformación en moléculas codificadas
por el alelo normal en una suerte de contagio a nivel molecular.
La proteína prionicas normal tiene solo α-hélices. En la proteína mutante, endógena o exógena, muchas de ellas son
remplazadas por hojas plegadas β. La proteína mutante puede inducir la aparición de hojas plegadas β en la proteína
normal.
Degradación
En la degradación de las proteinas pueden intervenir los
proteasomas o diversas vías que llevan al autofagolisosoma.
-Proteasomas: los proteasomas degradan proteinas
citosolicas, desnaturalizadas y ubicuitinadas; a menos que
pierdan la ubicuitina y sean replegadas por cochaperonas. (1)
-Fagocitosis: las proteinas endocitadas en vesículas
recubiertas por ubicuitinas o catrinas son incorporadas a los
endosomas que las encaminan hacia el lisosoma. Algunos
endosomas pueden reciclar las proteinas via retículo
endoplasmico, (2)
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-Microautofagia: el lisosoma incorpora proteinas citosolicas directamente. (4)
-Autofagia mediada por chaperonas: el lisosoma incorpora proteinas mediante chaperonas. (5)
-Macrofagia no selectiva: los desechos de gran tamaño son captados por fagoforos y van al autofagosoma. (6)
-Macrofagia selectiva: los desechos ubicuitinados son captados por fagoforos y van al autofagosoma. (7)
Expresión de los genes humanos y su control
ARTICULACIÓN DE PROCESOS
La expresión de los genes es un proceso complejo cuyas etapas pueden desarrollarse secuencial o prácticamente en
simultaneo y constituir instancias de control.
Un inductor extracelular pone en marcha el proceso al provocar la dimerización y activación del receptor en la MP.
Su ingreso activa un factor de transcripción que se halla en el citoplasma.
El factor de transcripción activado pasa al núcleo y, previa descompactacion de la cromatina, se une a una secuencia
regulatoria específica para seguir la iniciación de la transcripción acoplada al encapuchamiento.
El transcripto primario es procesado a medida que se sintetiza. Sintetizado el extremo 3´ se produce su clivado y
poliadenilacion.
El ARN maduro se une a proteínas antes de pasar al citoplasma. Allí es traducido por los ribosomas y la proteína es
transportada al compartimiento de destino donde se pliegue.
CONTROL EPIGENETICO
El funcionamiento del genoma, como la transcripción, está bajo
control epigenetico.
La instancia de control principal es la iniciación de la transcripción
acoplada al encapuchamiento de 5´ (C). También existen instancias
de control adicionales (C) y posibles instancias ©.
El control epigenetico consiste en:
-Modificación química del ADN y las histonas.
-Cambio de conformación de la cromatina.
-Operación de proteínas reguladoras.
-Interacción con ARN no codificante.
Efectores del sistema:
-Writers o escritores: introducen las marcas epigenéticas.
-Readers o lectores: reconocen las señales epigenéticas.
-Erasers o borradores: eliminan las marcas epigenéticas.
El sistema controla diferentes procesos o sus funciones son:
-Activación o represión de la transcripción.
La metilación del ADN se correlaciona en general con
desacetilacion de las histonas, mayor condensación de la cromatina
e inactividad transcripcional.
-Cambios en la replicación del ADN.
-Cambios en la reparación de daños en el ADN.
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Técnicas básicas en genética molecular
Los estudios genéticos de laboratorio requieren diversos procedimientos, de los cuales se deben discutir sus alcances
y limitaciones. Además debemos conocer el formato de los resultados de los estudios porque sirven para habilitar
ejercicios de aplicación conceptual y construir las competencias relacionadas al mismo.
MUESTRAS
La primera fase de un estudio genético es el muestreo. En general las muestras genéticas deben ser:
-obtenidas conforme a normas de bioseguridad que minimicen todo riesgo de exposición tanto para el donante
como para el operador.
-identificadas con los datos del donante que incluyen su nombre y apellido, fecha de nacimiento, además de la
fecha en la que fueron obtenidas las muestras y el nombre y apellido del operador.
-mantenidas bajo custodia hasta que sean totalmente consumidas.
-apropiadas según lo que se desee estudiar. Se puede obtener ADN genómico de cualquier célula nucleada pero si lo
que se investiga es la expresión especifica de algún gen en particular o el transcriptoma o proteoma de un tipo
celular determinado hay que asegurarse de que el mismo esté presente en la muestra.
-suficientes, lo que puede variar según el estudio que se realice y/o los protocolos del laboratorio de referencia.
-limpias y en lo posible libres de impurezas desde el momento del muestreo y hasta que sean consumidas por
completo.
-conservadas adecuadamente en todo momento, lo cual puede requerir una temperatura determinada y/o
conservantes químicos que prevengan la degradación del material de estudio.
El papel de filtro es una alternativa de bajo costo para estudios poblacionales de genes o metabolitos específicos,
sirve para recoger, desecar, remitir y almacenar gotas de sangre. Estas gotas pueden servir para investigar
metabolitos y otros estudios como la secuenciación del exoma y del genoma completo.
Los estudios genómicos más exigentes requieren de una alta estandarización por lo que los laboratorios de
referencia suelen proveer gratuitamente kits para la recolección de muestras y no solo de sangre. Por ejemplo:
Un tubo para saliva consta de un embudo y la tapa que guarda la solución conservante, de esta manera el material
genético de una muestra de saliva remitida a temperatura ambiente puede tardar más de 10 días en alcanzar el
laboratorio de referencia sin mayor degradación.
Un hisopado de mucosa oral secado al aire puede ser suficiente para investigar marcadores polimórficos como los
que se utilizan para la identificación forense y casos de filiación.
El ADN genómico presente en la raíz de un cabello y en las células del epitelio folicular adheridas al mismo puede
bastar para resolver un caso criminal. Más aun el tallo privado de la raíz puede tener algo de ADN genómico, aunque
lo usual es buscar en el ADN mitocondrial.
Una biopsia como la de piel ya que en muchos casos el material necesario deberá ser procurado por el especialista.
PREPARACION
En el laboratorio de referencia, la muestra es usualmente sometida a una o más de varias técnicas preparativas en
orden a obtener de ella el material que se va a analizar.
-Enriquecimiento la muestra y cultivo (tubos especiales)
-Purificación de la muestra
-Amplificación de la muestra → cambios cíclicos de temperatura, para producir la desnaturalización y la
fragmentación del ADN en sitios específicos (reacción en cadena polimerasa)
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Hay tubos especiales para separar, mediante centrifugación, las células
nucleadas de la sangre de los glóbulos rojos. Alternativamente tales células
pueden recuperarse de la capa blanquecina que queda en la parte superior
cuando se deja sedimentar la sangre heparinisada o del cultivo de unas
gotas de aquella, si lo que se procura obtener son linfocitos.
Obtenidas las células se pueden extraer y purificar ADN, ARN y proteinas.
A partir de ellas, mediante kits comerciales o procedimientos sencillos, uno
a más segmentos de ADN sin fragmentar pueden ser amplificados hasta
obtener miles de copias mediante una reacción de polimerización en
cadena o PCR. Para ello la molécula a copiar oligonucleótidos que definan
dentro de ella y a modo de primer o cebadores los extremos 5´ y 3´ del o
de los amplicones de interés nucleótidostrifosfato y una polimerasa
termoestable, como la TAC, se someten en un medio de reacción
adecuado a cambios cíclicos de temperatura que permiten la hibridación
de cada cebador con su respectiva cadena molde, su elongación y la
desnaturalización de la molécula resultante de manera repetitiva.
Alternativamente y dado que el ADN genómico consiste en moléculas de
gran tamaño, el mismo suele tener que ser fragmentado para hacer
posible su análisis. Si bien a veces para ello es suficiente someterlo a
medios físicos como la otransonicacion; en otras oportunidades conviene
recurrir a endonucleasas de restricción, enzimas bacterianas, que cortan
el ADN en sitios predeterminados, a menos que la secuencia respectiva
este metilada.
Una endonucleasa de restricción y la metilasa correspondiente forman el
sistema de modificación, verdadero sistema inmune de una especie
bacteriana.
La endonucleasa ataca todo ADN con el que se pone en contacto, excepto
el de la especie bacteriana que lo produjo porque este ha sido
previamente protegido por la metilasa en cuestión. Por ejemplo, la
secuencia blanco que la endonucleasa de restricción de escherichia coli
ECOR1 reconoce en una molécula de ADN, (GAATTC) para introducirse en
los cortes entre G y A (marcados con flechas rojas); excepto si las adeninas
en posición 3´ están metiladas. Cada cadena de la secuencia blanco suele
formar un palíndromo con su complementaria, es decir que ambas
cadenas presentan las mismas secuencias de nucleótidos siempre
respetando el anti paralelismo.
El ADN genómico fragmentado o bien ADN complementario obtenido
mediante retrotranscripcion de ARN o proteinas (transcriptasa inversa)
que existe en fragmentos discretos, pueden ser separados por
electroforesis en geles o cromatografía liquida para su análisis.
ELECTROFORESIS EN GEL
Southern blotting
Se extrae una muestra de ADN celular y este es cortado por endonucleasas de restricción lo que produce los
fragmentos de restricción.
Los fragmentos de restricción son separados por electroforesis en una placa de gel de agarosa para organizarlos
según su tamaño y poder localizar alguno de ellos específicamente.
Se trata el gel con una sn alcalina que desnaturaliza al ADN y provoca que las dos cadenas se separen.
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Para que los fragmentos de ADN contenidos en las
bandas electroforéticas del gel sean transferidos al
filtro de nitrocelulosa se coloca el gel sobre hojas de
papel con sn fisiológica y se aplica el filtro sobre él, y
sobre el filtro se ponen hojas secas absorbentes. La sn
salina asciende, por capilaridad, desde las hojas con
sn fisiológica hasta las secas y arrastra los fragmentos
de ADN que son transferidas al filtro para que su
manipulación sea más sencilla.
El filtro (sin gen ni papeles) se trata con una sonda
radiactiva de ADNc marcada con P
32
para localizar el
segmento de ADN, es decir, se hibrida el ADN con
una sonda radiactiva de ADNc por la
complementariedad de bases sonda-muestra. Se
coloca el filtro sobre una película fotográfica y,
mediante radioautografia, las bandas con ADN
quedan impresas en la película.
Para localizar los fragmentos de ADN en el gel de agarosa se confronta el gel con la película.
Existen técnicas semejantes para transferir ARN (Northern blotting) y proteinas (Western blotting).
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HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS
La hibridación permite detectar genes en los lugares que ocupan en los cromosomas. Primero se hibridiza el gen
que se desea detectar con un ADN complementario, que lleva un marcador o señal para poder ser identificado.
El material a investigar puede ser ADN genómico o complementario, ARN total o seleccionado.
La hibridación del ADN es el apareamiento de una cadena original con otra cadena de un origen diferente. Las
técnicas de hibridación de acidos nucleicos procuran la desnaturalización de los mismos y su posterior hibridación
con una sonda en función de complementariedad de bases.
La sondas pueden ser fragmentos de ADN genómico, ADNc u oligonucleótidos.
Las señales a incorporar a las sondas o al material investigado para permitir la visualización de la hibridación pueden
ser radioisótopos, fluorocromos (FISH – hibridación fluorescente) o moléculas reactivas.
Los blancos a poner en evidencia mediante la hibridación pueden ser genes, polimorfismos, otras secuencias
genómicas, transcriptos.
Los soportes físicos que requiere la técnica suelen ser medios solidos diversos como membranas flexibles, láminas de
vidrio o plástico.
Se deben considerar factores que afectan la termoestabilidad de moléculas originales e hibridos como temperatura,
la fromacion de sales y la formamida.
SONDAS DE ADN GENÓMICO, ADN COMPLEMENTARIO Y DE ARN
Las sondas de ADNc se usan para localizar/individualizar las colonias/el clon de bacterias que contienen el
fragmento de ADN que se desea aislar.
Se tiene un cultivo sembrado con clones de bacterias (contienen genes diferentes) sobre el que se coloca un papel
de nitrocelulosa, lo que las transfiere al papel formando una réplica del cultivo. Las bacterias se lisan y sus ADN se
desnaturalizan por calor.
La réplica en el papel se incuba con la sonda de ADN radiactivo complementario (P
32
) del segmento de ADN que se
desea hallar. El enfriamiento hace que el ADNc se hibridice con el ADN buscado.
Sobre el papel se coloca una película fotográfica; en la que mediante radioautografia queda impresa la posición del
ADN.
Al confrontase el cultivo con la película se identifica la ubicación de la colonia portadora del ADN.
Las sondas de ADNc son sintetizadas a partir de ARN (de células que los fabrican en gran cantidad), los cuales sirven
de moldes para los ADNc mediante la intervención de la transcriptasa inversa.
SECUENCIAMIENTO DEL ADN – SECUENCIACION AUTOMATICA DEL ADN
Las técnicas de secuenciación en general permiten conocer la estructura primaria o secuencia del ADN, del ARN
previamente retrotranscripto o no a ADNc e incluso de las proteínas.
La secuencia de los nucleótidos de un gen puede ser deducida a partir de la secuencia de los aminoácidos de la
proteína que codifica pero solamente se obtienen las partes codificadoras del gen ya que la técnica no aporta
información sobre segmentos reguladores ni de intrones, tampoco tiene en cuenta que la mayoría de aminoácidos
son codificados por más de un codón.
Varios métodos permiten obtener el secuenciamiento del ADN lo que hace posible conocer la composición de los
genes y cromosomas nucleares y mitocondriales. Estos métodos se basan en la producción de fragmentos de ADN de
longitudes crecientes, los cuales empiezan en un punto en común y poseen uno de los cuatro tipos de nucleótidos en
sus extremos terminales.
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