Ciclo de Krebs:
Estructura mitocondrial:
1. Membrana mitocondrial externa (outer membrane): bicapa
lipídica altamente permeable a iones, metabolitos y algunos
polipéptidos.
Presenta mochas copias de porinas (proteínas con forma de
barril) que forman un canal acuoso responsable del pasaje de
moléculas de hasta 5000 daltons.
2. Espacio intermembrana (intermembrane space):
composición similar al citosol de la célula. Presencia de enzimas y
proteínas específicas (adenilato quinasa, carnitina, etc.).
3. Membrana mitocondrial interna y crestas:
• Membrana interna (inner membrane): es impermeable para
iones y muchas moléculas. Es más hidrofóbica y presenta
transportadores específicos.
• Crestas (cristae): conforman un sistema membranoso conectado
con la membrana interna. Allí se encuentran los complejos de la
cadena respiratoria. La cantidad de crestas varía con el tipo de
célula y las condiciones energéticas.
4. Matriz (matrix):
• Su composición en iones y metabolitos es distinta al citosol.
• Contiene metabolitos y enzimas de rutas metabólicas centrales.
• Contiene ADN, ARN de transferencia, mensajero y ribosómico.
Porina
Las etapas del catabolismo:
Extraído de Lippincott’s Illustrated Reviews: Biochemistry
1. Hidrólisis de moléculas complejas: en la primera etapa, las moléculas
complejas se descomponen en sus unidades estructurales componentes. Por
ejemplo, las proteínas se degradan a aminoácidos.
2. Conversión de unidades estructurales en productos intermedios
simples: en la segunda etapa, estas unidades estructurales diversas se siguen
degradando a acetilcoenzima A (acetil-CoA) y otras pocas moléculas simples.
3. Oxidación de la acetil-coenzima A: el ciclo de los ácidos tricarboxílicos
(Ciclo de Krebs) es la vía común final en la oxidación de moléculas de
combustible como la acetil-CoA. La oxidación de acetil-CoA genera grandes
cantidades de ATP a medida que los electrones fluyen desde el NADH y el
dinucleótido de flavina y adenina (FADH2) hasta el oxígeno mediante la
fosforilación oxidativa.
Los procesos catabólicos convergen en el Ciclo de Krebs y la fosforilación
oxidativa, ambos tienen lugar en la mitocondria.
• Formación de piruvato en el citoplasma:
-Piruvato quinasa (último paso de la Glucólisis)
-Lactato deshidrogenasa (desde el lactato)
-Enzima málica (desde el malato)
-Alanina transaminasa (a partir de alanina)
-A partir de otros aminoácidos glucogénicos (serina, treonina, glicina, cisteína,
triptofano)
Fase preparatoria: (estado transitorio):
Como destino final de la glucólisis, se obtienen dos moléculas de piruvato.
Si la glucólisis ocurre en condiciones anaerobias (de poco o nulo oxígeno), los
NADH formados durante la glucólisis van a liberar los iones hidruro al piruvato,
transformándolo en ácido láctico, entonces el ciclo de Krebs no ocurrirá (porque
no se genera el estado transitorio).
Por el contrario, si las condiciones son aerobias, los NADH pueden dirigirse a la
cadena de transporte de electrones, y reducir al oxígeno (liberan sus iones
hidruro en éste). Entonces, el piruvato queda intacto.
En conclusión, el estado transitorio ocurre solamente en condiciones
aerobias (dentro de la mitocondria).
El piruvato es una molécula de tres carbonos; al final de la reacción, se vuelve
una molécula de dos carbonos (acetilo), es decir, ocurre una descarboxilación
(dicho carbono se elimina en forma de CO
2
), y se le adiciona una Coenzima-
A (CoA).
En defintiva, el piruvato, en condiciones aerobias, se transforma en Acetil-
CoA.
La descarboxilación es catalizada por una enzima, la cual también agrega la
CoA.
Además, el piruvato posee ciertos hidruros, por lo que la enzima va a agregar
NAD+ y oxidar al piruvato (sacarle electrones; en este caso hidruros),
produciendo NADH.
Como el producto final de la glucólisis son dos moléculas de piruvato, el
producto del estado estacionario son dos moléculas de Acetil-CoA, dos CO
2
y dos NADH.
El estado estacionario (cuyo conjunto de reacciones es irreversible) es
completamente regulado por la enzima piruvato deshidrogenasa que, en
realidad, es un complejo de tres enzimas.
Complejo de la piruvato deshidrogenasa (PDH):
La PDH es un complejo de tres enzimas, por lo que es conveniente estudiar
cada enzima por separado:
• Enzima 1: (piruvato descarboxilasa):
Dentro de esta enzima, se encuentra una
vitamina muy importante: tiamina (vit-B1). En
realidad, dicha vitamina no se encuentra en
estado libre, sino que está enlazada a dos
moléculas de fosfato (pirofosfato inorgánico),
por lo que se llama tiamina pirofosfato (TPP;
P por cada fosfato).
El piruvato que ingresa a la mitocondria
interacciona con la TPP y se produce la
descarboxilación (este es el paso limitante
de la velocidad del complejo), el carbono eliminado lo hace en forma de CO
2
(porque el piruvato tiene un grupo carboxilo, que al pH mitocondrial se
encuentra en la forma C-O-O
-
, en vez de COOH).
El resto del piruvato (los dos carbonos restantes) pasan a ser un grupo acetilo,
que se encuentra enlazado al TPP.
A continuación, la tiamina pirofosfato dice: “¿sabes qué?, no quiero más al
grupo acetilo; chau, andate”.
¿Hacia dónde irá ese acetilo?. Hacia la siguiente enzima del complejo de la
PDH.
Como la primera enzima del complejo de la PDH básicamente descarboxila al
piruvato (le extrae un carbono) que ingresa a la mitocondria, se le denomina
piruvato descarboxilasa. No obstante, también se le llama piruvato
deshidrogenasa, aunque parezca confuso.
El nombre piruvato deshidrogenasa puede referirse a dos cosas distintas: a la
piruvato descarboxilasa (la prima enzima del complejo enzimático) o al
complejo enzimático en sí mismo (complejo de la PDH).
• Enzima 2: (dihidrolipoamida transacetilasa):
Dentro de la segunda enzima de la PDH, se encuentra el ácido lipóico
(también llamado lipoato). Este ácido es muy importante porque tiene un
puente disulfuro (un enlace S-S).
Cuando el acetilo (previamente piruvato) pasa de la enzima 1 a la enzima 2,
éste interacciona con el lipoato y rompe el puente disulfuro, resultando que uno
de los sulfuros (S) de dicho puente se transforme en un grupo tiol (S-H),
mientras que el otro quedará enlazado al acetilo.
Por otra parte, se incorpora una Coenzima-A a la enzima 2, la cual interactúa
con el acetilo. Como resultado, se forma Acetil-CoA.
¿Qué pasó con el lipoato?. El sulfuro que estaba enlazado con el acetilo forma
otro grupo tiol. Entonces, ambos sulfuros del ácido lipóico quedaron
enlazados a Hidrógeno.
• Enzima 3: (dihidrolipoamida deshidrogenasa):
El problema con estos dos grupos tiol es que el lipoato queda inservible, ya
que necesita del puente disulfuro para poder interactuar con otras moléculas de
acetilo.
El FAD viene al rescate (que se encuentra fuertemente unido a la enzima
3), oxidando al lipoato (al capturar los dos hidrógenos de ambos sulfuros).
Como producto, se forma FADH
2
.
Surge otro problema: si viene una próxima molécula de acetilo, ¿qué sucede
con el FAD?.
Para que el FAD pueda interaccionar con una próxima molécula de acetilo,
debe deshacerse de esos dos hidrógenos que capturó del lipoato.
Para ello, dos moléculas de NAD+ vienen y lo oxidan, formándose dos
NADH, los cuales irán a la cadena de transporte de electrones (para generar
todavía más energía).
Esta tercera enzima del complejo de la PDH, esencialmente toma los
hidrógenos del lipoato (lo deshidrogena), por eso se llama dihidrolipoamina
deshidrogenasa.
Como el producto final de la glucólisis son dos moléculas de piruvato, el
estado estacionario genera dos moléculas de acetil-CoA, cuatro
moléculas de NADH y dos moléculas de CO
2
.
Aclaración: el estado estacionario genera dos moléculas de NADH por cada
molécula de piruvato que ingresa al complejo de la PDH, porque el lipoato tiene
dos sulfuros que necesitan ser deshidrogenados.
• En resumen:
Imagen de Lippincott’s Illustrated Reviews: Biochemistry
La piruvato deshidrogenasa es un complejo de tres enzimas:
1) Piruvato deshidrogenasa (tiene tiamina pirofosfato como coenzima)
2) Dihidrolipoamina transacetilasa (tiene como coenzima al ácido lipóico;
unido covalentemente).
3) Dihidrolipoamina deshidrogenasa (tiene FAD fuertemente unido)
Las otras dos coenzimas del complejo son: NAD y CoA.
Regulación del estado transitorio:
1. Regulación alostérica:
El complejo de la PDH está altamente regulado por dos enzimas: la PDH
quinasa y la PDH fosfatasa (una quinasa fosforila y una fosfatasa desfosforila).
• PDH quinasa:
En la ilustración, las manos de la PDH quinasa son fosfatos; éstos inhiben la
acción de la piruvato-descarboxilasa (la primera enzima del complejo).
En realidad, existen moléculas que son capaces de controlar a la PDH quinasa, y,
por lo tanto, la inhibición del complejo de la piruvato-deshidrogenasa.
Cabe destacar que la PDH quinasa es una enzima alostérica (en este caso, posee
dos sitios de regulación alostérica).
La función de la PDH quinasa es inhibir al complejo de la PDH.
Clave para entender la regulación alostérica: analizar qué rol tiene el efector dentro
de la célula, y tener en cuenta el rol de la enzima dentro del metabolismo.
Efectores positivos (que estimulan la PDH quinasa; que inhibe al complejo):
• Lógicamente, la célula deseará “apagar” al complejo de la PDH cuando
haya demasiado Acetil-CoA. En otras palabras, el Acetil-CoA actúa como
regulador/efector positivo de la PDH quinasa (la estimula; lo que
implica la inhibición de la PDH).
• Otra forma que tiene la célula de “darse cuenta” que hay suficiente
producción de Acetil-CoA (es decir, que necesita “apagar” al complejo de la
PDH), es una elevada concentración de ATP. Por lo tanto, el ATP actúa
como efector positivo de la PDH quinasa (la cual inhibe a la PDH).
• Otra alternativa para que la célula “detecte” la suficiente formación de
Acetil-CoA, y por tanto “desee” apagar a la PDH, es una alta concentración
de NADH, por lo que esta coenzima (el NADH) puede actuar como
efector positivo de la PDH quinasa (la estimula; lo que inhibe a la
PDH).
Efectores negativos (que inhiben la PDH quinasa; lo que estimula a la PDH):
• Por el contrario, cuando hay mucha cantidad de piruvato, la célula debería
querer “encender” al complejo de la PDH, por lo que deberá inhibir a la PDH
quinasa, porque de lo contrario impediría la acción del complejo. Es decir,
que el piruvato actúa como un efector negativo de la PDH quinasa (la
inhibe; lo cual implica la estimulación de la PDH).
• Un elevado nivel de ADP es otro indicador de que la célula “quiere” activar
al complejo. Hay que recordar que una elevada concentración de ADP
implica una baja concentración de ATP (debido a que éste se hidroliza).
Por lo que el ADP actúa como efector negativo de la PDH quinasa (la
inhibe; lo que estimula a la PDH).
• Piruvato-Descarboxilasa:
La primera enzima del complejo de la
PDH también posee sitios
específicos de regulación alostérica.
Efectores negativos: (inhiben a la
piruvato-descarboxilasa; “apagan” la
PDH)
Una elevada concentración de ATP
significa que hay mucha producción
de energía, por lo que no es necesario transformar piruvato en acetil-CoA (hay
que “apagar” al complejo de la PDH).
El ATP actúa como un efector negativo de la piruvato-descarboxilasa.
Una alta cantidad de NADH significa que se está produciendo mucho Acetil-
CoA, por lo que el NADH también puede “decirle” a la piruvato-descarboxilasa
que no es necesario producir más acetil-CoA (actúa como un efector negativo).
• PDH fosfatasa:
En la ilustración, a la PDH fosfatasa le
falta una mano (“un grupo fosfato”), por
lo que quiere recuperarla.
Como se observó con la PDH-quinasa,
la fosforilación de la primera enzima del
complejo de la PDH “apaga” al complejo
entero; por lo cual, la desfosforilación
(“que la PDH-fosfatasa recupere su
mano”) implica que el complejo de la
PDH “se encienda”.
Efectores positivos (que estimulan a la PDH-fosfatasa, lo que “enciende” a la PDH):
Por ejemplo, en la contracción muscular, se necesita mucha generación de
energía (ATP), por lo que el músculo necesita potenciar mucho la acción del
Ciclio de Krebs, el cual, a su vez, requiere de Acetil-CoA para producirse.
Se liberan grandes cantidades de calcio (Ca
2+
), parte de éste va a estimular a
la PDH-fosfatasa, lo que permite que quite los grupos fosfato de la piruvato-
descarboxilasa (la primera enzima del complejo de la PDH) y ésta se active,
estimulando que se produzca acetil-CoA a partir de piruvato.
Por lo tanto, el Ca
2+
es un efector positivo de la PDH-fosfatasa.
El Magnesio (Mg) también es un efector positivo de la PDH-fosfatasa.
2. Regulación hormonal:
• Insulina:
La insulina se libera cuando hay mucha cantidad de glucosa, por lo que
estimula la glucólisis (para que la célula pueda catabolizar (“simplificar”) dicha
glucosa en dos moléculas de piruvato).
Debido a que aumenta la concentración de piruvato, es lógico que la célula
“desee” estimular al complejo de la PDH para transformar a ese piruvato en
Acetil-CoA y producir ATP mediante el Ciclo de Krebs, es decir, darle una
utilidad a ese piruvato.
En síntesis, la insulina estimula al complejo de la PDH. ¿Cómo lo hace?. La
insulina estimula a la PDH-fosfatasa, la cual es una enzima que estimula
directamente al complejo.
Correlación clínica: Hay una condición llamada
Beri-Beri, que es una deficiencia de Tiamina, la cual
puede causar severas complicaciones neurológicas.
La falta de Tiamina (vitamina B) puede conducir a
pánico moderado/severo, parálisis en ciertos tipos de
músculos y, claramente, la muerte.
Debido a que la deficiencia de Tiamina también tiene
efectos en el corazón, puede conllevar edemas
(circulación lenta de la sangre e hinchazón de
extremidades).
La deficiencia de Tiamina es muy común en personas
alcohólicas y personas que consumen arroz blanco en
exceso. También puede ser una condición genética.
Lippincott’s Illustrated Reviews: Biochemistry
El síndrome de Wernicke-Korsakoff es una forma inusual de amnesia que combina dos
trastornos: un estado de confusión agudo (encefalopatía de Wernicke) y una amnesia
prolongada o a largo plazo (llamada síndrome de Korsakoff).
Nótese que un minúsculo cambio en el organismo (tal como puede ser la
deficiencia de Tiamina), puede desembocar en una cascada de condiciones.
Ciclo de Krebs:
• Paso cero:
Como paso previo, durante el
estado estacionario, se generaron
dos moléculas de Acetil-CoA a
partir de dos moléculas de
piruvato obtenidas de la
glucólisis.
La reacción global es catalizada
por el complejo de la piruvato
deshidrogenasa que, como ya
vimos, es un complejo compuesto
por tres enzimas, siendo la
primera (la piruvato
descarboxilasa) la más regulada
y la que define la velocidad de la
reacción.
• Primer paso:
Vamos a convertir al acetil-CoA (una
molécula de dos carbonos) en una
molécula de seis carbonos; para ello,
vamos a fusionarla con el oxalacetato
(que tiene cuatro carbonos). Dicha
reacción es irreversible, forma Citrato
y es catalizada por la citrato sintasa.
Esta enzima es alostérica y está muy
regulada:
Si hay mucha producción de ATP, la
célula va a querer detener el Ciclo de
Krebs, por lo que el ATP es un efector negativo.
Si existe una gran cantidad de NADH, esto significa que hay mucha actividad
de producción de energía. El NADH también es un efector negativo de esta
enzima (la inhibe).
Lógicamente, si existe mucho citrato es porque hay mucha actividad del ciclo
de Krebs, por lo que el citrato es un efector negativo de la enzima que
cataliza su síntesis, la citrato sintasa.
Siguiendo la misma lógica, el succinil-CoA es otro indicador de que hay
mucha actividad del ciclo, por lo que también actúa como efector negativo de
la citrato sintasa.
Como se vio anteriormente, el ATP se hidroliza en ADP y fosfato inorgánico, es
decir, que cuando hay una elevada concentración de ADP, existe baja
concentración de ATP, por lo que se necesita producir nuevas moléculas de
éste último.
El ADP, entonces, actúa como un efector positivo muy poderoso (estimula la
acción de la citrato-sintasa).
• Segundo paso:
Seguidamente, el citrato se convierte en
isocitrato. El prefijo iso- hace referencia a que
el sustrato (citrato, en este caso) está sufriendo
una isomerización (el tipo y cantidad de
átomos del citrato se mantienen iguales, solo
que modifican su distribución espacial, hay
cambios de enlaces dentro de la molécula).
Esta reacción es reversible y es catalizada por la aconitasa, la cual tiene un
centro de hierro-azufre que permite la unión de sustratos.
Existe un veneno para ratas que es fluoroacetato (el acetato es una molécula de dos
carbonos). La célula ignora al fluoroacetato, el cual es tomado como un acetilo, por lo
que el complejo de la PDH lo transforma en fluoroacetil-CoA, y esta molécula ingresa
al ciclo de Krebs, pasando a ser fluorocitrato.
El fluorocitrato es un inhibidor competitivo, ya que “compite” con el citrato por el sitio
activo de la aconitasa (la aconitasa con fluorocitrato tendrá un Km mayor, ya que la
afinidad de la enzima disminuirá).
• Tercer paso:
El isocitrato (tiene seis carbonos) se
transforma en α-ketoglutarato (una molécula
de cinco carbonos).
El isocitrato sufre una descarboxilación, que
elimina a un carbono en forma de CO
2
, debido
a que este se encuentra en forma de grupo
carboxilo (COO
-
), el cual, al pH mitocondrial, ya
ha perdido un hidrógeno, sino sería COOH.
Esta reacción es irreversible y es catalizada
por la isocitrato-deshidrogenasa, que genera
una molécula de NADH o de NADPH en dicha
transformación (existen dos tipos de
isocitrato-deshidrogenasa, una que forma
NADH y otra que forma NADPH).
Una deshidrogenasa siempre implica la formación de NADH.
La isocitrato-deshidrogenasa es alostérica. El ATP actúa como un efector
negativo, ya que le indica a la célula que no necesita producir más de cantidad
de esta molécula (ATP).
El ADP es un efector positivo de esta enzima, ya que una elevada
concentración de ADP implica una baja concentración de ATP gracias a la
hidrólisis de este último.
Por otra parte, si se piensa en la contracción muscular, por ejemplo, se puede
deducir que el Calcio se libera cuando se necesita producir mucha energía, es
decir, que se necesita estimular el ciclo de Krebs.
Por dicho motivo, el Ca
2+
actúa como un efector positivo de la isocitrato-
deshidrogenasa.
• Cuarto paso:
El α-ketoglutarato (tiene cinco carbonos)
se convierte en succinil-CoA (una
molécula que tiene cuatro carbonos).
La enzima que cataliza esta reacción
irreversible se llama α-ketoglutarato
deshidrogenasa, la cual es crucial.
Como toda deshidrogenasa, forma un
NADH.
En definitiva, el α-ketoglutarato sufre una
descarboxilación, por lo que el carbono
que pierde se va en forma de CO
2
.
Además, la enzima le agrega una Coenzima-A al α-ketoglutarato.
La α-ketoglutarato deshidrogenasa es alostérica.
El succinil-CoA actúa como un efector negativo al “avisarle” a la enzima que
debe detenerse porque ya hay muchas moléculas de éste.
Por otro lado, si existe una elevada concentración de NADH, esto significa que
hay mucha producción de energía, lo cual vuelve al NADH un efector negativo
de la α-ketoglutarato deshidrogenasa.
Al igual que en el paso anterior, si se piensa en la contracción muscular, se
puede pensar que el Calcio actúa como un estimulador de la producción de
energía; por lo cual, el Ca
2+
es un efector positivo de la α-KG deshidrogenasa.
Correlación clínica: en el organismo, el α-ketoglutarato es un cofactor de la
histona desmetilasa (una enzima que quita metilos (-CH
3
) de las histonas del
ADN, implicadas en la regulación de la expresión genética).
Cuando existe una mutación de la α-KG DH, que en vez de catalizar la
transformación de α-KG en succinil-CoA, con NAD, lo hace con NADP, cataliza
la formación de 2-OH-Glutarato a partir de α-ketoglutarato.
Este nuevo compuesto impide que el α-KG se una a la histona
desmetilasa, con lo cual, esta enzima no puede activarse.
Por lo tanto, la expresión genética no puede ser controlada de esta forma,
lo que puede conllevar la generación de tumores, principalmente gliomas
(de la neuroglía).
• Quinto paso:
El succinil-CoA va a transformarse en succinato.
Esta reacción es reversible y es catalizada por la
enzima succinil-CoA Sintetasa (en realidad es
un complejo estructuralmente similar e
idéntico en función al de la Piruvato-
deshidrogenasa).
En esta reacción, se pierde la Coenzima-A, lo
cual implica la liberación de una mínima cantidad
de energía, que es almacenada por la mitocondria
en la forma de GTP (guanosin-trifosfato), es decir,
que la mitocondria “agarra” un GDP y lo une a un fosfato inorgánico (P
i
).
¿Cuál es la molécula predilecta para almacenar energía a nivel celular?. El
ATP.
Por ello, un ADP se vuelve “envidioso” de que el GTP haya sido el elegido para
almacenar la energía de la liberación de la CoA; así que el ADP va y “enfrenta”
al GTP, robándole el Pi. Por lo que el GTP se hidroliza y el ADP se vuelve ATP.
Esta forma de transferir un P
i
se conoce como fosforilación a nivel del
sustrato.
• Sexto paso:
El succinato se convierte en fumarato.
Esta reacción es reversible y es catalizada por una enzima muy especial
llamada complejo enzimático II (participa en la cadena respiratoria), también
se le llama succinato deshidrogenasa.
El malonato es un gran inhibidor competitivo de esta enzima.
En la ilustración se observa como esta enzima se encuentra “de pie” sobre las
crestas de la mitocondria.
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