Muchas gracias por la ayuda. Se agradece la NO difusión ya que la transcripción, el agregado de
información de libros y la consiguiente edición conllevó muchísimas horas de trabajo. ¡Éxitos!
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“Inmunología”
Cátedra I
2021
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Seminario: #8
Inmunología: “Técnicas inmunológicas”
Desarrollo:
➢ Tabla de técnicas
Técnica
Interacción
Utilidad
Ej. analito
Datos útiles
IDR (Inmuno Difusión
Radical)
Secundaria
(Precipitación)
Cuantitativa
Concentración sérica de
IgG, IgM e IgA o
elementos de elementos
del complemento (C1-
C9, factor H, factor I,
factor B, C1 inhibidor)
Los analitos son solubles
IEF
(Inmunoelectroforesis)
Secundaria
(Precipitación)
Cualitativa
Inmunogloblulinas
Se hace a partir de muestras
biologicas como suero
Aglutinación
Secundaria
Semi-
cuantitativa
(da un titulo)
Grupo (ABO) y factor (Rh -
/+), Diagnostico de
Chagas, Brucelosis,
Toxoplasmosis
Depende el protocolo se la puede
usar para medir antigenos
particulados o Ac que reconocen
determinado antigeno.
Inmunomarcación
Primaria
Cualitativo
Se usa sobre: Celulas
fijadas, sobre un soporte o
sobre tejidos con el fin de
saber tambien la
ubicación del antigeno
Se puede marcar con enzimas,
pero lo mas frecuente es la
inmunofluorescencia
Citrometría de Flujo
Primaria
Cualitativo
(me permite
definir en
comparación)
Se ven los Ag de superficie
de celulas que pasan de a
una por el equipo
Es una inmunomarcación. Técnica
cara. Antes de ingresar al equipo
la muestra debe estar en solución.
RIA
(RadioInmunoEnsayo)
Primaria
Cuantitativo
Ag solubles de los cuales
se tenga Anticuerpo
especifico y Ag marcado
radioactivamente.
Muy sensible pero peligrosa, son
ensayos de competencia.
PRIST
Primaria
Cuantitativo
IgE total en suero
Se hace sobre un soporte de papel
que tiene adheridos Ac anti-IgE.
RAST
Primaria
Cuantitativa
IgE especifica para un
Antigeno
Se hace sobre un soporte de papel
que tiene adherido al Ag que
reconoce a la IgE que se quiere
estudiar
ELISA
Primaria
Cuantitativa
Ag solubles y Anticuerpos
Son reacciones que dan color y se
cuantifican con un
espectofotometro
Western Blot
Primaria
Semi-
cuantitativa
Proteinas o Ac en suero
contra una proteina
especifica
Primero separo por peso
molecular y despues se marca con
Anticuerpo. Especifico la banda
*Técnicas basadas en la interacción antígeno-anticuerpo
-Anticuerpo: posee 2 paratopes
-Antígeno: puede tener uno o múltiples epitopes que pueden ser idénticos o diferentes entre si
-Complejos inmunes: redes de Antígenos unidos a Anticuerpos
➢ Interacción antígeno-anticuerpo
-Interacción primaria
• No visualizable (hay unión, pero no se forman complejos inmunes)
• Antígeno monovalente (Ag posee un solo epitope)
• Requieren método de revelado
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-Interacción secundaria
• Visualizable (forma CI y hay un fenómeno visualizable)
•Antígeno multivalente (Ag posee multiples epitopes) (la cuantificación requiere
que tanto el Ag como el Ac sean al menos bivalentes)
•Requieren altas concentraciones de Ag/Ac para la formación de redes
visualizables. A la proporción correcta de Ag/Ac se la llama → zona de
equivalencia
➢ Algunos conceptos
-Sensibilidad: capacidad de una técnica o estudio complementario de detectar pacientes enfermos, es decir, que sean
positivos para el resultado de la muestra y diagnostique la enfermedad.
/Un método poco sensible se usa para medir cosas en alta concentración
/Un método muy sensible detecta bajísimas concentraciones, son siempre más caros
-Especificidad: capacidad de una técnica de detectar a un paciente sano, es decir, de dar negativo cuando realmente
lo se. Una muestra poco especifica dará un falso positivo en un paciente que está en realidad sano.
-Valencia: cantidad de uniones posibles
-Fenómenos visualizables de las interacciones secundarias
/Precipitación: se da cuando los antígenos son solubles y los CI se
depositan en el fondo de la muestra.
/Aglutinación: se da cuando los antígenos son particulados (parte de una
molécula más grande) y llevan a la formación de grumos. Es más sensible
que la precipitación, pero mucho menos sensible que las técnicas de
interacción primaria.
*Directa: el Ag que participa es particulado de por sí →
importante en detección de Ac en suero.
*Indirecta: el Ag particulado se forma “pegando” Ag no particulados a una partícula que suele ser un
Glóbulo Rojo o una partícula inerte de latex.
*Indirecta reversa: se inmovilizan sobre la partícula al Ac
especifico. Se usa para determinar ese Ag en solución.
-Clasificación según resultado:
/Técnicas cuantitativas: el resultado es un numero con una unidad
específica para la magnitud que estoy midiendo.
/Técnicas cualitativas: el resultado se expresa en un valor no
cuantificable, no es un número. También pueden ofrecer el resultado
positivo o negativo.
/Técnicas semi-cuantitativas: cuando las cualitativas se expresan en forma de estadística, no dan un numero,
pero dan una relación.
*Inmunodifusión radial:
-Técnica secundaria por precipitación.
-Técnica cuantitativa (a través de una curva de
calibración).
-Baja sensibilidad.
-Mide:
-Concentración sérica de IgG, IgM e IgA
-Concentración sérica de elementos del
complemento (C1-C9, factor H, factor I, factor B, C1
inhibidor)
-Se utiliza una matriz de medio sólido, es un gel.
-La técnica se basa en la difusión de la muestra
conteniendo el antígeno a medir (inmunoglobulinas o antígenos solubles) en una matriz semisólida de agar en la que
se encuentra disuelto el Ac específico (Ac monoclonal) →Para que haya precipitacion tanto el Ac como el Ag deben
ser al menos divalentes.
-Técnica poco sensible y lenta (24 hs).
-Requiere concentraciones altas de antígenos (baja sensibilidad) para poder medirlos (por ser secundaria). Por este
motivo no se puede medir IgE, que posee concentraciones bajas en plasma.
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-Tiende a ser reemplazada por técnicas turbidimétricas que emplean anticuerpos contra la proteína de interés,
formando complejos inmunes insolubles, cuantificándose la turbidez por espectrofotometría.
-Se utiliza en la clínica, por ejemplo: Para el diagnostico de nefritis lupica, lesión que se produce por depósito de
complejos inmunes en el glomérulo → CI activan la via clasica → busca Complemento no escindidos.
*Hemaglutinación directa
➢ Hemaglutinacion directa → Grupo y Factor para transfusiones.
-Glicoproteinas de membrana de los globulos rojos → son antígenos particulados porque son parte del glóbulo rojo.
/Antígeno A: AA o AO
/Antígeno B: BB o BO
/Antígeno A+B: AB
/Antígeno D: Rh + si lo poseo, - si no.
-Técnica secundaria por aglutinación directa → Hemaglutinacion (porque lo que aglutinan son partículas de GR)
-Técnica cualitativa.
-Hay 3 placas → Se deposita una gota de anti cuerpo anti-A en placa 1, anti- B en placa 2 y anti-D en placa 3. Luego
observo en el portaobjeto si aglutina la sangre, en la placa que aglutine → significa que posee antígeno
➢ Hemaglutinación indirecta
→ Chagas
-Técnica secundaria por aglutinación indirecta (antígeno particulado)
/Se incorporan antígenos del Chagas al glóbulo rojo, se incorpora el suero del paciente y si aglutinan con los
globulos rojos → Suero del paciente posee los Ac contra el Chagas → Indirecta
/De la misma manera, se pueden incorporar anticuerpos Anti-Ag del chagas al globulo rojo → Busco si el suero
del paciente posee los Ag del chagas → Indirecta Reversa
*Titulo
-VDLR: técnica de aglutinación en moléculas de carbón que permite encontrar Ac anti-
Ag de sífilis.
➢ Título:
-Permite cuantificar la aglutinación por dilución de los sueros → se realiza la incubación
de diluciones seriadas del suero del paciente con cantidades constantes de Ag.
-Definición de título: máxima dilución de suero que produce aglutinación visible (se suele
medir como la inversa de la máxima dilución: 1/4, 1/8, 1/16).
-Permite comparar con los resultados de otros pacientes para ver la
carga → Cuanto más diluciones positivas, mas Ac posee el paciente.
-Es entonces, un estudio semi-cuantitativo.
-Teniendo dos muestras de suero de un mismo paciente tomadas a
diferentes tiempos, es posible comparar mediante esta técnica el
título de Acs en ambas muestras → SEROCONVERSIÓN: es la aparición
de Acs o el aumento del título de Acs en 4 veces, en un periodo entre
3 y 4 semanas.
• Fenómeno de prozona:
-Para la formación de redes de complejos inmunes, necesito que la cantidad
de Ag y Ac sea similar, es decir, que haya un equilibrio.
-Fenomeno de prozona: Cuando hay exceso de Ac o de Ag → NO hay
aglutinación (visualizable), porque se forma Ac-Ag soluble → Se obtiene un
falso negativo
-En la zona de equivalencia (Ac=Ag) Se forma el complejo inmune
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➢ Título IgG-IgM
-Determina si el título de Ac obtenido en una reacción de aglutinación directa o indirecta corresponden a IgG o a la
suma de IgM más IgG. Esto se debe a que ambos tipos de inmunoglobulinas son aglutinantes.
-Tratamiento con 2-Mercaptoetanol (2ME): destruye la union pentamerica de la IgM que pasará de ser pentamerica
a monomerica. La IgM monomerica pierde capacidad de formar complejos inmunes. De esta manera, la titulacion con
2ME corresponderá exclusivamente a la actividad aglutinante de la IgG.
-La caída en el título del suero por aglutinación en ausencia vs. en presencia
de 2-ME es indicio de la presencia de IgM específica para el parásito.
Ej: Si el titulo era 1/64 sin 2ME, pero con 2ME es 1/8, significa que
ese octavo pertenece a la IgG y el resto era IgM → posiblemente estaba cursando una infeccion aguda.
-Uso clinico:
*RadioInmunoAnalisis (RIA)
-Es primaria
-Permite cuantificar la presencia de pequeñas
cantidades de un determinado Ag o Ac en una
muestra biológica.
-Sumante sensible
-Utiliza radioisótopos.
-La técnica se basa en la inhibición competitiva de
la unión de un Ag marcado radiactivamente con su
Ac especifico, por parte de Ags idénticos no
marcados presentes en la muestra a analizar.
-Para realizar la técnica debe contarse de antemano
con:
1) Acs específicos contra la molécula a cuantificar (esa molécula puede ser un Ag o Ac)
2) La molécula a cuantificar marcada radioactivamente → Ag caliente
3) la muestra a analizar (donde se encuentra la molécula a cuantificar) → Ag frio
-Complejos inmunes formados por la molécula marcada (Ag caliente) y el anticuerpo específico se enfrentan a la
muestra que posee la molécula sin marcar (Ag frío).
Si la concentración de Ag frío es mayor → desplazamiento del Ag caliente → radioactividad de los complejos
Ag-Ac disminuye → radioactividad de la fracción de Ag libre aumentará.
-Realizando una curva patrón con concentraciones conocidas de Ag libre puede calcularse, luego, la concentración de
Ag en la muestra biológica.
*ELISA
-Metodo primario.
-Para la confirmacion de la infeccion cronica del diagnostico de Chagas, usted debe tener dos resultados positivos por
dos técnicas diferentes Por ejemplo: hemaglutinacion indirecta y ELISA indirecto para el diagnostico
➢ ELISA Directo
-Se utiliza para detectar antigenos.
-Tecnica de interacción primaria.
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1) El Ac específico para el Ag de interés, se encuentra adsorbido en un soporte sólido (placa de petri)
2) Se añade la muestra biológica.
3) En el caso de que en dicha muestra se encuentre el Ag, quedará capturado en la placa.
4) Se adiciona otro Ac específico contra el Antigeno de interes, conjugado con una enzima colorimetrica.
5) Lavar la placa para que se vaya el AC del punto anterior que no se haya unido al complejo Ag-AC.
5) Se añade el sustrato incoloro que, por acción de la enzima colorimétrica, dará un producto coloreado que producirá
un color observable a simple vista y cuantificable mediante un espectrofotómetro.
➢ ELISA Indirecto
-Se utiliza para detectar anticuerpos.
-Técnica cualitativa o cuantitativa.
-El Ag del AC de interés se encuentra adsorbido en la placa de ELISA. Este Ag puede ser una proteína viral o bacteriana
e incluso un virus completos.
-Se agrega el suero del paciente.
-Se agrega un AC-anti porción Fc del AC del paciente.
*Determinaciones de IgE por PRIST y RAST
-Técnicas primarias
-Se busca medir IgE en el suero del paciente. Por ejemplo: Origen Alérgico
-Igual a la ELISA, pero el metodo de revelado en vez de ser una enzima es un radioisotopo (Acs anti-IgE marcado
radioactivamente).
• PRIST: mide la IgE total, ya que el disco posee Ac de captura anti-IgE que se unen a la porcion constante de la
IgE total.
• RAST: en el disco esta pegado un tipo de alergeno de interes, por lo que se unira la IgE especifica antigeno en
particular.
-Luego, en ambos casos se agrega el AC anti-IgE marcado radioactivamente y se lee la radioactividad.
*Inmunomarcación:
-Es una tecnica cualitativa y de interaccion primaria
-Las técnicas de inmunomarcación utilizando Ac conjugados permiten detectar la presencia de Ags en tejidos o células
→ ubicar espacialmente el antigeno en el cuerpo
-El Ac puede estar conjugado con:
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/Inmunoflourescencia
/Inmunoperoxidasa (enzima colororimetrica)
-La imunomarcacion de tejidos se realiza sobre cortes de tejido fijado montado sobre un portaobjetos o en celulas
vivas → Por ejemplo: observar el deposito de complejos inmunes a nivel glomerular en Nefritis Lupica (Lupus)
-Se pueden detectar tanto Ags celulares (de membrana, citoplasmáticos o nucleares) como extracelulares (matriz
extracelular, membrana basal, etc.)
➢ Inmunomarcación DIRECTA
-Consiste en utilizar un Ac "marcado" específico para dicho Ag (Ac primario).
-Se incuba la muestra con el Ac primario "marcado" durante un determinado
tiempo, luego del cual se retira el exeso de Ac mediante un lavado y se procede
a la detección de la marca
➢ Inmunomarcación INDIRECTA
-Utiliza un Ac primario sin marcar que reconoce al Ag de interés y luego, para
evidenciar la presencia del Ag, emplea un segundo Ac marcado (Ac
secundario) capaz de reconocer el Ac primario.
-Para realizar esta técnica, se incuba la muestra con el Ac primario, tal como
vimos anteriormente, se realiza un lavado para retirar el exeso de Ac y luego
se incuba con el segundo Ac marcado. Posteriromente se realiza un lavado y
se procede a la detección de la marca.
*Citometria de flujo (CMF)
-Procedimiento altamente eficiente para caracterizar poblaciones celulares que se encuentren en suspensión.
-Identifica:
/El fenotipo celular, es decir la expresión diferencial
de antígenos en la membrana plasmática
/Parámetros estructurales y funcionales: como el
tamaño y la granularidad
-Aplicaciones:
/Marcadores de superficie
/Citoquinas
/Apoptosis
/Ciclo celular
/Proliferacion celular
/Factores de transcripcion
/Proteinas de señalizacion
-Ventajas: Se puede analizar un número muy elevado de células en pocos segundos y la posibilidad de cuantificar la
intensidad de fluorescencia.
-Desventajas: Alto costo de la adquisición y mantenimiento del citómetro de flujo.
-La maquina es capaz de medir componentes y propiedades de células y organelas celulares (partículas biológicas) que
fluyen en una suspensión celular monodispersa.
-Muestra: sangre periférica
-Se utiliza en biomedicina con diferentes objetivos:
/En hematología: contaje celular, fórmula leucocitaria, contaje reticulocitario, análisis de médula ósea.
/En farmacología: estudios de cinética celular.
/En inmunología: subpoblaciones de linfocitos, estimulación linfocitaria →Diagnostico de leucemia linfoide o
alteraciones de la formula leucocitaria.
*Fórmula leucocitaria:
/Neutrofilos segmentados: 50-65%
/Linfocitos: 25-40%
/Monocitos 4-10%
/Eosinofilos: 1-5%
/Basófilos: 0-2%
*Las Células mononucleares totales (CMT) están conformadas por:
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/Monocitos: 5-15%
/Linfocitos: 85-95%
*Linfocitos T: entre 60-80% →relación normal promedio T CD4:CD8 es 2:1.
*Linfocitos B: entre 5-10% → relación kappa: lambda normal promedio es 2:1.
(Si la relacion K:L es alterada → leucemia clonal B)
*Células NK: entre 10-20%
/En oncología: diagnóstico/pronóstico, monitorizar tratamiento.
/En microbiología: diagnóstico bacteriano y vírico, sensibilidad a antibióticos.
➢ Procedimiento
-Las células en suspensión son forzadas a pasar, de a una por vez, a través de un filamento muy delgado.
-Un haz de rayo láser incide en cada célula lo que resulta en la dispersión de la luz en distintas direcciones.
-Una serie de tubos fotomultiplicadores (FM) detectan la luz dispersada brindando información acerca de:
/Tamaño
/Granularidad o complejidad celular
/Emisión de fluorescencia en el caso de que la célula haya unido un anticuerpo marcado con un fluorocromo
intra o extracelular.
➢ Análisis y presentación de los resultados:
1) Gráfico “dot plot” de tamaño vs granularidad:
-En el eje de las X, se representa el tamaño celular y en el de las Y la
granularidad. Se pueden distinguir entonces:
/Neutrófilos (de mayor complejidad granular por la presencia de
lisosomas y tamaño intermedio)
/Monocitos (de complejidad intermedia, pero mayor tamaño)
/Linfocitos (pequeños y sin gránulos en el citoplasma).
2) Histograma de fluorescencia
-Ej: células monocítica marcadas con un anticuerpo monoclonal dirigido
contra el antígeno CD18.
-El anticuerpo está marcado con isocianato de fluoresceína (FITC)
(fluorescencia verde) y es de isotipo IgG1 murino especifico para CD18.
-Control de isotipo:
/En un tubo uso Ac fluorescente del mismo isotipo que se uso
para la citometria pero que no sea especifico.
/Función:
*Descarta uniones inespecificas del Ac porque puede
unirse a moleculas que no sean el Ag especifico (union
de Ac con otras proteinas no especificas (como Fuerzas
de Van Der Walls o de carácter hidrofilico)
*Descartar la autofluorescencia de las celulas humanas
/Resultado: se realiza la CMF → La fluorescencia que aparece
es por interacciones inespecificas o autofluorescencia de las
celulas.
/Se resta la fluorescencia total, menos la fluorescencia del
control de isotipo → Da la fluorescencia real de la muestra.
3) Gráfico “dot plot” de fluorescencia verde (FL1) versus fluorescencia
roja (FL2):
-Células son marcados simultáneamente con 2 anticuerpos:
/Anti-CD4 marcado con FITC (eje de las X)
/Anti-CD8 marcado con ficoeritrina (PE) (eje de las Y)
-Se distinguen 3 poblaciones:
/Cuadrante superior izquierdo: LT CD8 positivos
/Cuadrante inferior derecho: T CD4 positivos
/Cuadrante inferior izquierdo: las células que no expresan ni CD8
ni CD4 (linfocitos B, células NK).
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/Cuadrante superior derecho: ausencia de puntos indica que no hay células que expresen simultáneamente
CD4 y CD8. Si se hubiesen marcado células de timo (estadio DP), se encontrarían en este cuadrante.
4) Ag Intracelulares:
-Tratar células con inhibidores de transporte
intracelular.
-Fijar y permeabilizar las células.
-Realizar la inmunomarcación (incluyendo el control
de isotipo).
-Analizar.
*Pruebas funcionales:
-Estudio de capacidad proliferativa: Tecnica in vitro
-Prueba de Mantoux (IDR): Tecnica in vivo
/Respuesta a vacuna BCG en niño
/Evaluación de contacto reciente con TBC en adultos
/Estudio de la respuesta inmune celular in vivo (pacientes sospechados de padecer IDP)
/Estudio de pacientes con hipersensibilidad
➢ Ensayo de Reducción del Nitroblue Tetrazolium (NBT)
-Técnica cualitativa y estudio funcional
-Evalúa la capacidad microbicida de células PMN
(principalmente neutrófilos) del sistema inmune a través
de la conversión un compuesto químico incoloro, el NBT,
en un compuesto intensamente coloreado.
-Se le extrae sangre al paciente y se separan los neutrófilos a los cuales se les agrega el NBT.
-Los neutrófilos tienen la enzima NADPH Oxidasa que es capaz de generar intermediarios reactivos del oxígeno que
son los responsables de convertir: NBT incoloro → en un compuesto azul oscuro: Formazán.
/Individuo sano, más del 95% de los neutrófilos son capaces de reducir el NBT.
/Enfermedad granulomatosa crónica neutrófilos tienen alguna alteración en el funcionamiento de la enzima
NADPH Oxidasa → sólo entre el 20% y el 80% de los neutrófilos son capaces de reducir el NBT.
*Es una enfermedad ligada al gen X.
*Con que el 10% de los neutrófilos conserve la funcionalidad, no se observan síntomas → Portador
asintomatico (generalmente mujer).
*Si las sospechas de padecer la enfermedad son altas, se deberán realizar ensayos más específicos:
/Por ejemplo: Estudio por citometría de flujo con reducción de 1, 2, 3 Dihidrorodamina (DHR) que
dará fluorescencia si la DHR se oxida por la NADHPH oxidasa. Se puede observar el resultado en el
histograma de fluorescencia.
➢ Ensayo de evaluación de actividad bactericida
-Estudio funcional de técnica cuantitativa.
-Este ensayo evalúa la función fagocítica de las células del sistema inmune.
-Se le extrae sangre al paciente y se separan los neutrófilos o monocitos
-A estas células se les agregan bacterias opsonizadas (Staphylococcus aureus), se incuba a 37ºC
-Se extraen muestras a intervalos de 30 minutos durante 2 horas.
-Muestras son plaqueadas en agar sangre e incubadas durante toda la noche a 37ºC → es un medio de cultivo nutritivo
enriquecido con sangre. Sirve para detectar bacterias que liberan
exotoxinas llamadas hemolisinas capaces de lisar los glóbulos rojos.
-Esto permite que las bacterias crezcan y formen colonias visibles.
-Así, se cuenta el número de colonias para cada tiempo de extracción y se
grafica el nº de colonias vs tiempo.
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-A medida que el tiempo de incubación es mayor, el número de colonias sea menor porque las células del paciente
fagocitan a las bacterias y, por lo tanto, cada vez hay menos bacterias.
*Western Blot
-Técnica muy sensible que permite identificar Ags y Acs.
1) La separación electroforética de proteínas en geles de poliacrilamida. La
migración de las proteínas se realiza en presencia de detergentes (Dodecil
Sulfato de Sodio, SDS) a fin de que su migración dependa
fundamentalmente de peso molecular (PM) de los péptidos.
2) La transferencia (blotting) de dichas proteínas a un soporte sólido
(membrana de nitrocelulosa o nylon)
3) Posterior detección de una o más bandas identificadas por Acs
específicos.
-Permite investigar la presencia de un antígeno dado en una mezcla de
proteínas presentes en una determinada muestra y para ello se debe
disponer del Ac específico para marcar la membrana.
-También es útil para la detección de Acs específicos en sueros → Si se
desea detectar Acs específicos, debe contarse con el Ag de interés separado
por electroforesis y transferido a una membrana, la cual se incubará con el
suero a analizar. Posteriormente esa membrana deberá incubarse con el segundo anticuerpo marcado con la enzima
para poder detectar las bandas específicas.
-Se utiliza para determinar la especificidad de los Acs contra Ag del virus de HIV es la prueba confirmatoria de elección
para los casos en que los sueros de los pacientes dieron un ELISA positivo.
*Inmunoelectroforesis:
-Es una técnica cualitativa que permite la identificación de
diferentes componentes proteicos presentes en distintas
muestras biológicas (suero, orina, etc) a través de arcos
de precipitación → que representan union Ac-Proteina.
-La técnica se realiza preferentemente en geles de agarosa
y se distinguen dos etapas:
1) La muestras se someten a una separación
electroforética.
2) Terminada la electroforesis, las proteínas
interaccionan con los Acs específicos aplicados en
el agar en un canal paralelo al eje de migración.
Luego de un período de difusión de los Acs, se
observan arcos de precipitación cuya forma y
posición dependen de las características
inmunoquímicas y de la concentración de cada
proteína.
*Anticuerpos monoclonales:
-Inmortalización de plasmocitos por fusión con células de mieloma de ratón.
-Las células fusionadas (hibridomas) producirán inmunoglobulinas idénticas a las que producía el plasmocito.
-Por dilución terminal se puede aislar (clonar) cada hibridoma, mantenerlo y expandirlo en cultivo.
➢ Hemograma
-Cantidad GR
-Volumen corpuscular medio (VCM)
-Cantidad de Hb por glóbulo rojo (HCM)
-CHCM
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-Cantidad de Hb total
-Hematocrito
-Plaquetas
-Formula blanca → leucocitaria
➢ Qué técnicas utilizaría a fin de:
a- Cuantificar IL-2 en un sobrenadante de cultivo de linfocitos.
ELISA.
b- Realizar una determinación de grupo sanguíneo y Factor Rh.
Aglutinación.
c- Detectar anticuerpos depositados en la membrana basal del riñón en una biopsia practicada a un paciente que se
sospecha que padece un Síndrome de Goodpasture. Biopsia e inmunomarcación.
d- Determinar los niveles de expresión de la molécula CD18 en los granulocitos de un niño que padece un cuadro
compatible con una inmunodeficiencia LAD1 (infecciones recurrentes, neutrofilia marcada y ausencia de
neutrófilos observables en lesiones de piel).
Citometría de flujo.
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Seminario: #9
Inmunología: “Inmunidad en mucosa”
Desarrollo:
➢ Generalidades:
-En las mucosas se establece una modulación fina de la respuesta inmune cuyo objetivo principal es la inducción de
tolerancia local frente a antígenos inocuos y la generación de una vigorosa respuesta inmune frente a los
microorganismos patógenos.
-Antígenos dietarios inócuos o bacterias comensales no deben inducir una respuesta inmune exagerada (EJ: Celiaquía).
Deberán generar una respuesta de tolerancia local.
-La continuidad del epitelio constituye una formidable primer barrera frente a los microorganismos presentes en la
luz.
➢ Enterocitos
-Se unen en su porción apical por uniones:
▪ Estrechas (parte más apical mediada por ocludinas y claudinas. Forman una especie de cinturón que se asocia
al citoesqueleto, con carácter de unión fortificado para limitar el paso de sustancias)
▪ Adherentes (E-Cadherina asociada al citoesqueleto)
▪ Desmosomas (Cadherinas)
-Los tres tipos de uniones son modulables:
▪ Citoquinas inflamatorias como el TNF- y el interferón-, y la anafillotoxina C5a → “relajan” las uniones
estrechas incrementando su permeabilidad para beneficiar la resolución de la infección con PMN
▪ Las citoquinas IL-10 y TGF-
, por el contrario, incrementan la resistencia al pasaje de macromoléculas.
-Presentan la mayoría de los TLR, los cuales exhiben un patrón de expresión particular que evita un estado de
inflamacion constante:
▪ La expresión de los TLR es baja en condiciones basales (ausencia de infección), pero se modula por acción de
las citoquinas. El TNF-α y el IFN-γ incrementan la expresión de TLR-4, mientras que IL-4 e IL-13, la disminuyen.
▪ Los TLR-3, -4 y -5 se expresan preferentemente en la superficie basolateral. Por lo tanto, el acceso de PAMPs
a estos TLR se encuentra restringido a situaciones en las cuales la continuidad de la barrera epitelial está
comprometida.
▪ La funcionalidad de ciertos TLR muestra un perfil polarizado. La activación de TLR9, por estímulos ofertados
desde la superficie basolateral (no desde la apical) da lugar a la activación de respuestas proinflamatorias
como la producción de IL-8.
➢ Propiedades de los enterocitos:
1. Los enterocitos expresan RRP y receptores de citoquinas
2. Producen citoquinas y quimiocinas en respuesta a la infección y también en condiciones homeostáticas.
3. Promueven el reclutamiento de neutrófilos gracias a su capacidad de producir IL-8.
4. Producen péptidos anti-microbianos de forma constitutiva (principalmente las células de Paneth). También
producen: Lisozima (Hidroliza Gags de bacterias), lactoferrina (Une hierro, bajando su disponibilidad), componentes
del sistema complemento, etc.
5. Producen mucinas (células de Goblet).
6. Sintesis de TSLP
*Sintesis: Los enterocitos producen citoquinas y quimiocinas, IL-8 e IL-33, péptidos antimicrobianos, mucinas, TSLP,
TGF-B y PGE2
➢ Moco:
-Producido por las células de Goblet.
-Posee 10-700 μm de espesor
-Se encuentra constituido por glico-proteínas de alto peso molecular (mucinas).
-Las mucinas (glicoproteínas que forman olímeros para otorgar características viscosas) se integran a la cara apical del
epitelio junto con enzimas degradativas (glucocálix)
-Tiene corta vida media (minutos/horas).
• Funciones:
a) Dificultar el acceso del patógeno a la células epitelial.
b) “Barrer” el patógeno al exterior por movimiento ciliar o peristálticos.
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c) Bloquear receptores expresados por los patógenos.
*Sistema inmune adaptativo en las mucosas
-Es el mayor sistema de tejidos linfoides de mamíferos. En un humano adulto contiene aproximadamente el 80% de
los linfocitos del organismo y es donde se produce la mayor cantidad de inmunoglobulinas en un individuo sano.
➢ MALT (Tejido linfoideo asociado a mucosas)
-Es un conjunto de tejidos linfoides organizados, en intimo contacto con la mucosa, donde se activan linfocitos en
respuesta a los antígenos que ingresan a través de estas superficies. Según a la mucosa que se asocien:
• GALT: tejido linfoideo asociado al tracto gastrointetsinal
• BALT: tejido linfoideo asociado al árbol bronquial
• NALT: tejido linfoideo asociado al tracto nasofaríngeo
• Tejidos linfoideos asociados a glándula mamaria
• Tejidos linfoideos asociados a glándulas salivares y lagrimales
• Tejidos linfoideos asociados a órganos génito-urinarios
• Tejidos linfoideos asociados al oído interno
•
➢ Organización del sistema inmune en las mucosas
-Cuando llega el patógeno habrá sitios inductivos y sitios efectores:
• Inductivos →Donde transcurre la activación de los LT y B naive en respuesta a Ag que ingresan por mucosas.
Son: Nalt, Balt, Galt y ganglios drenantes como el mesentérico. Al activarse, se dirigen por vía linfática → Cond.
Torácico → Circulación general → Una vez en sangre los linfocitos activados harán homing al tejido mucoso.
• Efectores →Donde se reclutan los LT efectores y de memoria y los plasmoblastos. Son el epitelio y lámina
propia.
➢ Sistema Inmune de la mucosa gastrointestinal
-Organización → Los linfocitos en el intestino se pueden encontrar en tejidos organizados.
-Sitio inductor → donde se induce la respuesta inmune
▪ GALT:
- Placa de Peyer del intestino delgado
- Folículos linfoides asilados
- Apéndices vermiformes y
▪ Ganglios mesentéricos
/ GALT:
• LT y LB vírgenes
• LT efectores (recién activados).
• CD maduras
-Sitio efector → dispersos en la lámina propia y epitelio donde llevan a cabo sus funciones efectoras.
/Lámina propia y epitelio:
• LT efectores. LT memoria (TME)
• Plasmocitos de vida media larga y corta.
• Células linfoides innatas (ILCs).
• CD inmaduras
➢ Estructura de los ganglios mesentéricos y placas de peyer
-Los conductos reticulares fibroblásticos se encuentran presentes en
ambas estructuras.
-Estructura de ganglios → igual a los estudiados.
-Estructura placa de Peyer:
▪ Amarillo: Zona B con folículos primarios internos (Allí se
encuentran las CDF)
▪ Azul: Zona T con conductos fibroreticulares.
▪ Tienen VHE por donde ingresan LT/B naive a la placa de Peyer.
Requiere la interacción CCR7 con CCL19/21.
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▪ No tiene capsula → Los antígenos ingresan directamente a partir del epitelio (Cel. M).
▪ No tiene vasos linfáticos aferentes, pero si eferentes (Aferentes de los ganglios mesentéricos).
▪ Zona del domo subepitelial: Entre las zonas T/B y el epitelio. Rica en CD.
▪ FAE (Epitelio asociado al folículo): El epitelio que está por encima de las placas de Peyer en el intestino delgado,
y sobre los folículos aislados a lo largo del intestino, contiene células epiteliales M.
-Células M
▪ Son células epiteliales especializadas.
▪ Alta capacidad endocítica.
▪ Baja capacidad degradativa.
▪ Baja capacidad de presentación de péptidos antigénicos por CMH I.
▪ Glicocálix escaso → Mayor contacto con antígenos de la luz epitelial.
▪ Sin receptores para translocar IgA → No hay una alta concentración de IgA cerca de ella, lo que aumenta las
chances de contacto con antígeno.
▪ Establecen uniones estrechas con los enterocitos adyacentes.
▪ Profundas invaginaciones de su membrana celular → Para estar en contacto con cel del sistema inmune.
▪ Función central: transporte transepitelial de antígenos vía:
A) Formación de vesículas endocíticas cubiertas de clatrina: lo cual favorece la internalización de
macromoléculas y virus reconocidos por receptores de la célula;
B) Endocitosis en fase fluida: lo cual permite la internalización de moléculas no reconocidas por receptores
específicos;
C) Mecanismo clásico de fagocitosis: es implementado con ciertas bacterias y parásitos, e involucra la emisión
de pseudópodos y el atrapamiento de la partícula en un fagosoma.
▪ Desventaja: puerta de entrada de ciertos patógenos.
➢ Ingreso del antígeno a través de la mucosa intestinal
1. Vía M, la más importante.
2. Pasaje a través de las células epiteliales (paracelular y transcelular)
3. Tomado directamente por proyecciones de las células dendríticas que alcanzan el lumen. Las células dendríticas
‘abren’ las uniones estrechas (ocludinas y claudinas) sin desestabilizar las permeabilidad. Estas células expresan,
sobre sus dendritas, los componentes que forman las uniones estrechas (ocludina y claudina) y establecen, a través
de ellas, uniones transitorias con los enterocitos adyacentes. Tras unos minutos, las dendritas se retraen hacia el
cuerpo de la célula dendrítica y se restablecen las uniones entre los enterocitos.
-Cuando hay citoquinas inflamatorias, o cuando las CD reconocen PAMPs /DAMPs por sus RPPs, ganan importancia las
ultimas dos vías.
➢ Activación y tráfico de linfocitos intestinales.
-Los LT naive se activan en placas de Peyer o ganglios mesentéricos
expresan L-selectina y CCR7, pero no 47 (integrina) y CCR9.
-Pueden diferenciarse en diferentes perfiles efectores.
-Posteriormente se diferenciarán en LT de memoria centrales (TMC) y
efectores (TME).
-Las células efectoras (T y B) y los TME expresan 47 (integrina) y CCR9
(receptor de quimiocinas CCL25) que permitirá su reclutamiento desde
la circulación, por medio de sus ligandos en el endotelio que irriga a
lámina propia intestinal.
-CCL25 →Quimiocina. Es sintetizada por células epiteliales del intestino,
se pega a los GAGs del endotelio. Cuando toma contacto con CCR9,
estimula el aumento de la afinidad de la integrina 47 por MadCam-1
expresado en las venulas del endotelio plano que irrigan la lamina
propia.
-MadCam → Adhesina ligando de la 47. Cuando su unión es de alta
afinidad, adquiere la adherencia estable → Paso limitante en el proceso de extravasación.
-Luego, inicia la diapédesis del linfocito hacia la zona de mayor concentración de CCL25. Desde aquí pueden ser:
/Linfocitos de la lámina propia
/Linfocitos intraepiteliales (entran en íntimo contacto con las células epiteliales). Estos expresan,
además, E7 → permitirá su unión firme a los enterocitos, que expresan su ligando, la molécula E-
cadherina.
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-La activación de CCR9 y alfa4beta7 específicos es gracias al Ac. Retinoico. Este es sintetizado por la enzima RALDH a
partir de la vitamina A en las CD derivadas de la mucosa intestinal que activen a Linfocitos. La expresión de la enzima
es inducible por factores de las células epiteliales como el TSLP.
➢ Linfocitos intraepiteliales (LIEs)
-Son el 50% de los LT del organismo.
-El 80% corresponden a LIEs CD8+ residentes
-Pueden expresar TCRs con cadenas αβ (mayoria) o ɣδ.
-No expresan CCR7.
-El correceptor CD8 puede expresarse en forma clásica (heterodímero αβ) o estar constituido por dos cadenas α.
/Propiedades funcionales:
-Primera línea de defensa en el intestino.
-Exhiben actividad citotóxica: destruyen células epiteliales “estresadas” o dañadas, preservando la integridad del
epitelio → Modulan la cinética de renovación de células epiteliales al inducir apoptosis.
-Secretan citoquinas → Juegan un rol regulatorio en la tolerancia a antígenos dietarios a través de la secreción de IL-
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-Son muy móviles y muestran un patrón de migración estructurado sugiriendo un actividad de vigilancia.
➢ Activación de linfocitos B vírgenes
-Los antígenos ingresan vía célula M (mayoritariamente) hacia el área B donde se produce la activación normal (1ra
Colaboración T-B). Luego puede ser un plasmoblasto de vida media corta o realizar la segunda para ser un
plasmoblasto de vida media larga.
-Los plasmoblastos migran por vía linfática y regresan por vía hemática donde se instalarán en la lámina propia,
mayoritariamente, plasmocitos secretores de IgA.
-Cambio de isotipo
/El factor TGF-β producido por las CD de la mucosa induce switch a IgA. El acido retinoico hace de cofactor del
TGF-β
-B1
/Son T independientes.
/Importantes para el control de bacterias comensales
/Se activan en sitios inductivos. Reciben señales de CD como April, BAFF y TGF-B que inducen su activación y
diferenciación a plasmoblastos secretores de anticuerpos IgA.
/Estos plasmoblastos son reclutados de la sangre para depositarse en la lámina propia vía receptores CCR9 e
integrina α4β7.
-Conclusión → La activación de LB vírgenes en el GALT le impone dos particularidades:
1) Promueve el cambio isotípico hacia la producción de Ac IgA. El TGF-β (producido por macrófagos, c.
dendríticas, LB y LTreg de la lámina propia) cumple un papel fundamental.
2) Los plasmoblastos provenientes de LB que se activaron en el sitios inductivos de la mucosa intestinal
expresan α4β7 y CCR9, lo que favorecerá el asentamiento de los plasmoblastos IgA+ en la lámina propia
intestinal.
-Tabla de homing de plasmoblastos:
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